牛輪狀病毒動物模型建立及疫苗研制進(jìn)展

拜小強(qiáng)，魏鎖成

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030)

0 引言

牛輪狀病毒性腹瀉是由牛輪狀病毒(Bovine rotavirus)引起的牛常見多發(fā)病，多見于7日齡及以下的犢牛，以精神沉郁、食欲廢絕、消化道機(jī)能紊亂及水樣腹瀉為主要臨床癥狀[1].牛輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，自1969年Mebus[2]首次從Nebraska新生牛犢腹瀉糞便中分離到NCDV株以來，世界各地均有RV感染報(bào)道.1980年福建畜牧獸醫(yī)研究所首次在我國發(fā)現(xiàn)BRV[3]，之后在內(nèi)蒙古、西藏、黑龍江、新疆、四川等地也相繼發(fā)現(xiàn)BRV[4-6].新生犢牛RV發(fā)病率常達(dá)60%～80%，死亡率高達(dá)30%，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[7].

1 牛輪狀病毒生物學(xué)特性

輪狀病毒體呈球形、無包膜，電鏡下形似輻射車輪狀而得名.病毒粒子直徑約70～75 nm，由外部衣殼、內(nèi)部衣殼和核心三層組成二十面體立體對稱結(jié)構(gòu)，內(nèi)含11個(gè)片段不連續(xù)的雙鏈RNA病毒基因組，分別編碼病毒的6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP6)，其中第11個(gè)片段編碼2個(gè)蛋白(NSP5和NSP6)，其余基因片段均編碼1個(gè)蛋白.根據(jù)VP6蛋白抗原性的不同，病毒分為A～G共7個(gè)組，牛群感染A組輪狀病毒最為常見[8].根據(jù)VP4、VP7蛋白分為G型和P型，目前已發(fā)現(xiàn)有27個(gè)G型和35個(gè)P型[9].據(jù)報(bào)道，全球牛輪狀病毒流行優(yōu)勢株為G10P[11]、G10P[5]和G10P[1][10]，國內(nèi)則以G10和G6為優(yōu)勢流行毒株[11]，2008年常繼濤等[4]在國內(nèi)首次分離出G10型牛輪狀病毒.

輪狀病毒對理化因素有較強(qiáng)的抵抗力，分離培養(yǎng)較為困難，易感細(xì)胞選擇和胰蛋白酶處理是細(xì)胞培養(yǎng)輪狀病毒的關(guān)鍵，常用培養(yǎng)效果最好的細(xì)胞是恒河猴腎傳代細(xì)胞MA-104[12]，已成功培養(yǎng)多種輪狀病毒株.輪狀病毒在各種動物之間有一定的交叉感染，病人、動物及隱性感染帶毒者是重要的傳染源，主要通過糞-口途徑傳播.牛感染RV潛伏期為12～96 h,近一半的犢牛腹瀉病例病程達(dá)1～8 d，病死率達(dá)10%～50%.主要病理特征為病毒感染絨毛上皮細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，造成小腸絨毛縮短，機(jī)能減退.該病傳播迅速，多發(fā)生于晚秋至早春的寒冷季節(jié)，衛(wèi)生條件不良、潮濕、驟冷或有疾病侵襲(如腺病毒、病毒性腹瀉病毒、產(chǎn)毒素性大腸桿菌交叉感染)等可促使病情加劇，病死率增高.BRV的病原學(xué)檢測方法包括經(jīng)典檢測技術(shù)(電鏡和免疫電鏡)、免疫學(xué)檢測技術(shù)(PAGE、ELISA)以及基因檢測技術(shù)等，RT-PCR方法因精準(zhǔn)、特異和簡便而被廣泛采用，半套式RT-PCR可進(jìn)一步對輪狀病毒分型鑒定.

2 輪狀病毒疫苗研究進(jìn)展

輪狀病毒腹瀉對人類和動物所造成的損害不可忽視，在全球已成為一項(xiàng)重要的公共衛(wèi)生問題.輪狀病毒感染普遍，目前尚無治療輪狀病毒感染的特效藥物[13].臨床上主要采取輔助對癥治療，如使用止瀉藥物減輕腹瀉癥狀，抗生素類藥物防止細(xì)菌繼發(fā)感染，微生態(tài)制劑維持腸道菌群平衡，靜脈注射葡萄糖鹽水和碳酸氫鈉溶液等補(bǔ)液以防止脫水和酸中毒等，但僅限治療，無法預(yù)防和徹底阻斷病毒傳播.接種輪狀病毒疫苗是預(yù)防輪狀病毒感染的有效手段，輪狀病毒疫苗的研究已取得了一定的成果.目前疫苗有單價(jià)人-牛重配疫苗Rotavac、五價(jià)人-牛重配株RV疫苗RotaTeq、單價(jià)羔羊LLR疫苗羅特威、單價(jià)HRV減毒疫苗Rotarix和Rotavin-M1.

2.1 非人源輪狀病毒疫苗

1969年Mebus首次分離BRV NCDV株[2]，該毒株被應(yīng)用于疫苗研制.1983年比利時(shí)RIT研究所Smith Nine通過胎牛腎細(xì)胞和猴腎細(xì)胞傳代154次獲得減毒株,首次制得口服輪狀病毒活疫苗RIT 4237[14]；1985年Vesikari Timo等[15]采用雙盲法測試疫苗臨床效果，進(jìn)一步證實(shí)口服減毒輪狀病毒疫苗具有免疫性；1986年美國費(fèi)城Wistar研究所和法國Merenx研究所在Pennsylvania腹瀉犢牛糞便中分離出BRV WC3株，經(jīng)非洲綠猴細(xì)胞系傳代12次制備出G6型牛株WC3減毒疫苗，臨床試驗(yàn)表明抗體反應(yīng)主要針對牛輪狀病毒，約50%的疫苗接種者血液中能產(chǎn)生免疫抗體[16]；G3型恒河猴輪狀病毒疫苗MMU-18006由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)從恒河幼猴腹瀉糞便中分離，經(jīng)猴腎細(xì)胞傳9代后獲得減毒株制備成口服疫苗[17].臨床試驗(yàn)表明該疫苗耐受性良好，有較高的免疫原性，新生兒服用后血清IgA抗體明顯升高，但服苗后有持續(xù)且較高的排毒率，感染異體風(fēng)險(xiǎn)增加.以上三種單價(jià)減毒疫苗由于不同國家地區(qū)保護(hù)性、流行株的血清型存在差異，動物毒株異型免疫保護(hù)效果不穩(wěn)定、保護(hù)率較低等因素，未能得到上市推廣.

1985年蘭州生物制品研究所從腹瀉新生羔羊腸內(nèi)容物分離出羊輪狀病毒，經(jīng)牛腎細(xì)胞傳代獲得穩(wěn)定傳代的適應(yīng)株蘭州羔羊輪狀病毒[18](Lanzhou Lamb Rotavirus,LLR株)，并用LLR株G10P[12]型減毒株制得口服輪狀病毒活疫苗，于2001年1月獲得中國藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，商品名為羅特威.經(jīng)上市前大量臨床試驗(yàn)和上市后近20年的臨床應(yīng)用，羅特威對重癥RV腸胃炎保護(hù)效力為88%,住院病例保護(hù)率為85%，保護(hù)效果穩(wěn)定，未見不良反應(yīng)報(bào)道.該疫苗是全球最早獲得國家批準(zhǔn)的疫苗，也是目前我國上市的一種幼兒輪狀病毒單價(jià)疫苗，對我國控制輪狀病毒流行和降低輪狀病毒腹瀉發(fā)病率具有重大意義.

BRV NCDV株是最早分離出來的牛源輪狀病毒株，減毒培養(yǎng)后被用于單價(jià)(RIT 4237疫苗[14])和多價(jià)重組疫苗(五價(jià)BRV-PV[19])的研制.牛G6型輪狀病毒分離株NCDV-lincoln減毒疫苗于1973年在美國批準(zhǔn)生產(chǎn)，犢?？诜臃N和肌肉注射均可獲得免疫保護(hù)，是目前世界范圍內(nèi)惟一的商品化牛輪狀病毒疫苗[20]，對犢牛輪狀病毒腹瀉預(yù)防有著十分重要的意義.常繼濤[21]研發(fā)的BRV(LLR-85和R191株)基因重組二價(jià)減毒疫苗和魏鎖成[22]研發(fā)的BRV GSB 01株VP7基因重組疫苗，初步驗(yàn)證均具有較好的免疫原性.

2.2 人源輪狀病毒減毒疫苗

1988年在美國Cincinnati腹瀉幼兒體內(nèi)分離出野生毒株，葛蘭素史克公司經(jīng)非洲綠猴腎細(xì)胞Vero連續(xù)傳代培養(yǎng)后，獲得穩(wěn)定人輪狀減毒RIX4414株G1P[8]型，商品名為Rotarix的單價(jià)口服減毒疫苗[23]，于2005年1月在墨西哥率先上市，后在歐洲等100多個(gè)國家獲得批準(zhǔn)上市，由于該疫苗免疫效果良好，對重癥RV腸胃炎保護(hù)效力為91%，住院病例保護(hù)率為85%，成為WHO推薦的輪狀病毒疫苗[24].

單價(jià)減毒疫苗Rotavin-M1，由越南衛(wèi)生部疫苗與生物制品研究中心從越南腹瀉兒童體內(nèi)分離獲得的HRV株G1P[8]型研制而成，2014年在越南批準(zhǔn)上市.Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)表明該疫苗的免疫原性和安全性與Rotarix相似.Dang等[25]在越南嬰幼兒中進(jìn)行不同劑量免疫原性研究，2個(gè)劑量方案和較高的滴度劑量接種免疫效果更佳，證實(shí)對越南嬰幼兒安全且具有免疫原性.

澳大利亞醫(yī)學(xué)家在輪狀病毒感染幼兒體內(nèi)分離獲得疫苗候選株型RV3株G3P[6]，2002年對制得的試驗(yàn)疫苗進(jìn)行Ⅱ期臨床雙盲隨機(jī)試驗(yàn)，結(jié)果顯示54%受試者產(chǎn)生了免疫保護(hù)[26].

2.3 動物-人輪狀病毒重組疫苗

四價(jià)恒河猴-人重配RV疫苗是第一個(gè)在美國批準(zhǔn)上市的輪狀病毒疫苗，商品名為RotaShield.1985年美國NIH的Kapikian以G3型恒河猴RRV株為親本，將人輪狀病毒G1、G2、G4型的VP7基因片段重組獲得RRV-TV株制得疫苗[27]，于1998年經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)惠氏公司(Wyeth)生產(chǎn)，并推薦美國嬰兒進(jìn)行接種.然而上市推廣后發(fā)現(xiàn)服用該疫苗與嬰幼兒發(fā)生腸套疊病例有關(guān)聯(lián)，于1999年被迫撤出市場[28].此后，輪狀病毒疫苗研制將腸套疊癥狀作為嚴(yán)格安全評價(jià)項(xiàng).

五價(jià)人-牛重配株RV疫苗是美國惟一在售的輪狀病毒疫苗，商品名為Rota-Teq.該五價(jià)疫苗以牛的WC3株G6P[5]型為基礎(chǔ)毒株經(jīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)制得[29]，其中四價(jià)重配病毒為HRV親本株血清型G1～G4外殼蛋白VP7和BRV WC3親本株血清型P7黏附蛋白VP4；第五價(jià)重配病毒為HRV親本株血清型P1A[8]黏附蛋白VP4和BRV WC3親本株血清型G6外殼蛋白VP7.Ⅲ期臨床試驗(yàn)的受試者中，該疫苗隨機(jī)接種后42天內(nèi)相關(guān)嚴(yán)重不良事件發(fā)生率≤0.1%，與對照組相比疫苗未顯著增加腸套疊的風(fēng)險(xiǎn)，對預(yù)防G1～G4、G9型導(dǎo)致的輪狀病毒嬰幼兒腹瀉保護(hù)率為74%[30].2006年2月Merck公司經(jīng)美國食品藥品管理局批準(zhǔn)疫苗上市，截止2017年在95個(gè)國家和地區(qū)投入使用.口服五價(jià)重配輪狀病毒減毒活疫苗(Vero細(xì)胞)中文商品名為樂兒德，于2018年4月12日經(jīng)中華人民共和國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，授權(quán)智飛生物公司推廣，成為我國引進(jìn)的首批輪狀病毒疫苗.

單價(jià)人-牛重配疫苗Rotavac是印度自主研制的輪狀病毒疫苗，也是首批完全在發(fā)展中國家發(fā)現(xiàn)、開發(fā)并生產(chǎn)的疫苗之一.1985年印度新德里醫(yī)院分離出人輪狀病毒親本株116E-G9株G9P[11]型，經(jīng)減毒弱化后與牛源VP4基因重配制得單價(jià)重配疫苗.經(jīng)4532名新生兒臨床Ⅲ期試驗(yàn)表明，重癥輪狀病毒胃腸炎兒童的保護(hù)效果達(dá)56%.Chandola等[31]研究表明Rotavac可以與其他兒童疫苗(脊髓灰質(zhì)炎、百日咳和破傷風(fēng)疫苗)一起安全使用.Rotavac疫苗于2015年在印度首次上市，由于經(jīng)濟(jì)適用被納入國家免疫計(jì)劃措施[32].

蘭州生物制品研究所利用人RV G2、G3、G4型和羊株LLR制得重配人-羊三價(jià)基因重配疫苗，已完成了Ⅲ期臨床觀察.黃騰[33]等對其安全性和免疫原性初步研究顯示安全性良好，并具有一定的免疫原性.武漢生物制品研究所研制的人-牛六價(jià)基因重配疫苗(Vero細(xì)胞)為六價(jià)UK重配株輪狀病毒活疫苗，已完成Ⅰ、Ⅱ期臨床研究，正在我國河北、湖南、浙江和廣西4省開展Ⅲ期臨床研究.此外國內(nèi)多家單位正在開展五價(jià)及多價(jià)疫苗的研究，希望能覆蓋更多的血清型使得免疫群體得到更全面的保護(hù).

2.4 輪狀病毒生物技術(shù)疫苗

目前，在世界范圍內(nèi)上市的預(yù)防輪狀病毒的疫苗主要為減毒活疫苗和基因重組疫苗，生物技術(shù)疫苗因其安全性好、成本低等優(yōu)勢，成為新型輪狀病毒疫苗研制新趨勢.生物技術(shù)疫苗是利用生物技術(shù)制備的分子水平的疫苗，包括基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、抗獨(dú)特性疫苗、基因工程活載體疫苗、DNA疫苗及轉(zhuǎn)基因植物疫苗等.生物技術(shù)疫苗在其他動物病毒疫苗研制中已經(jīng)取得了一定的成果，如口蹄疫病毒VP1亞單位疫苗、豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗、豬瘟E2蛋白亞單位疫苗、偽狂犬病基因缺失疫苗等.

RV結(jié)構(gòu)黏附蛋白VP4、內(nèi)衣殼蛋白VP6、外衣殼蛋白VP7和非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4已經(jīng)初步應(yīng)用到疫苗研究中，BRV疫苗開發(fā)研究主要集中在基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、病毒樣顆粒疫苗(VLP)、轉(zhuǎn)基因植物疫苗等方面，相關(guān)研究試驗(yàn)初步證實(shí)疫苗有效可行.生物技術(shù)疫苗作為輪狀病毒疫苗研制的新途徑，為更安全高效的疫苗研制提供可能，但由于病毒血清型和基因型眾多，抗原結(jié)構(gòu)功能和激發(fā)機(jī)制存在盲區(qū)，對人類和動物機(jī)體的安全性和有效性還需進(jìn)一步證實(shí)后才能全面投產(chǎn).

3 牛輪狀病毒感染小鼠模型

輪狀病毒動物模型對于病毒致病機(jī)理、疫苗研制、疫苗保護(hù)性驗(yàn)證以及藥物篩選有重要作用.用于研究BRV感染的動物模型以母本未受感染且未攝入初乳的陰性新生犢牛為最佳，但新生犢牛篩選較為嚴(yán)苛且成本高昂，相對而言，小鼠模型具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用、便于篩選、容易操作等優(yōu)點(diǎn)，BRV小鼠模型包括感染后出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉癥狀的乳鼠腹瀉模型和感染后無明顯腹瀉的成年小鼠感染模型.

小鼠模型最初主要用于研究BRV致病機(jī)理、胃腸組織病變和感染臨床表現(xiàn).Ciarlet等[34]應(yīng)用BRV WC3株灌胃滴度為8×106FFU/mL病毒原液，致使5～21d Lewis大鼠有效感染，建立感染模型.通過觀察臨床癥狀、測定糞便和腸道中感染性病毒滴度、腸組織病理變化、免疫熒光檢測小腸切片抗原分布等方法，證實(shí)牛輪狀病毒感染大鼠在其腸道內(nèi)檢測到抗原，小腸上皮細(xì)胞發(fā)生空泡.該模型可以研究輪狀病毒的發(fā)病機(jī)理和腸道感染的分子機(jī)制，以及不同日齡小鼠輪狀病毒感染差異.

小鼠模型除了研究BRV感染和腹瀉機(jī)制之外，更多的被用于疫苗制備后獲得免疫情況初步評價(jià).Yang[35]等建立小鼠感染模型，對BALB/c小鼠進(jìn)行肌肉接種牛輪狀病毒VP6 DNA疫苗可獲得免疫應(yīng)答和保護(hù)，表明通過VP6 DNA疫苗免疫可以獲得異源保護(hù).Diego[36]在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)了BRV C-486株G6P[1]型VP6蛋白，重組VP6多肽免疫幼鼠建立模型，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的被動免疫保護(hù)，并證實(shí)分泌的乳汁中含有大量抗體可產(chǎn)生免疫保護(hù).Ijaz[37]建立了更為全面的小鼠感染輪狀動物模型，用減毒和滅活的BRV進(jìn)行不同免疫途徑(灌胃、肌肉注射、乳腺內(nèi)皮注射)免疫母鼠，對哺乳的幼鼠體內(nèi)乳原性抗體產(chǎn)生情況進(jìn)行評價(jià).三種感染途徑免疫后均能在幼鼠血清中檢測到乳源抗體，前5周抗體滴度增加，后期逐漸下降，其中乳腺內(nèi)皮注射能產(chǎn)生最佳抗體應(yīng)答，IgG為主要抗體，其次是IgM和IgA，口服滅活的BRV免疫也能產(chǎn)生良好的抗體反應(yīng).

此外，還可以利用小鼠模型尋求更多的途徑來抵抗BRV的感染.G?k?e[38]建立的輪狀病毒感染的小鼠模型中，HBC抗體和乳酸桿菌益生菌株的組合比單獨(dú)使用HBC更有效地減少了腹瀉.Peralta[39]建立不同濃度梯度BRV腹瀉乳鼠模型，研究雞卵黃中特異性免疫球蛋白IgY對牛輪狀病毒引起的腹瀉小鼠的被動保護(hù)，用IgY處理過的小鼠感染BRV后腹瀉癥狀明顯減輕，使用IgY對抗由BRV引起的腹瀉方式是可行的.Lentz[40]利用BRV VP8基因與煙草重組在葉綠體中合成穩(wěn)定的C486 VP8蛋白，感染雌性小鼠中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，成功建立了小鼠模型，驗(yàn)證表明口服免疫孕鼠后所產(chǎn)仔鼠可免受輪狀病毒的攻擊.

張儉偉[41]將BRV CHLY株在恒河猴腎細(xì)胞系(MA-104)上增殖，制備病毒抗原液，甲醛滅活后加入佐劑制備疫苗，2次免疫昆明小鼠產(chǎn)生了較高水平IgG抗體，試驗(yàn)表明制備的牛輪狀病毒甲醛滅活疫苗具有較好的免疫原性，免疫后可顯著提高體內(nèi)特異性抗體水平.魏鎖成等[12]利用感染BRV GSB01株VP7基因構(gòu)建pET32a-VP7和pET32a-VP7-ltb表達(dá)重組蛋白，建立免疫小鼠模型.結(jié)果顯示免疫新生小鼠的保護(hù)率分別為86.4%和91.7%，利用該模型初步驗(yàn)證了亞單位疫苗的可行性.

4 總結(jié)與展望

牛輪狀病毒是犢牛病毒性腹瀉的主要病原體之一，環(huán)境中存在廣泛、成年牛只隱性感染、流行迅速、發(fā)病率高等特性.雖然目前多種檢測技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測病毒的存在，但有研究證實(shí)可在種間傳播，給預(yù)防群發(fā)性感染帶來困難，目前尚無高效的預(yù)防措施完全阻止病毒傳播.感染牛只通常采用對癥療法，服用治療腹瀉藥物減輕癥狀，提高抵抗力，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡來緩解，并無特效藥物.

接種疫苗是預(yù)防輪狀病毒高效、經(jīng)濟(jì)的有效途徑.成熟的病毒分離、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和適配的動物模型是疫苗研制的前提，小鼠在篩選、飼養(yǎng)、取樣等方面都具有優(yōu)勢，鼠模型特別是幼鼠腹瀉模型被應(yīng)用于初期疫苗試驗(yàn).RV疫苗研制國內(nèi)外取得了較好的成果，我國目前有2種口服疫苗上市，用于預(yù)防幼兒免受輪狀病毒感染.BRV基因型眾多且易重排、型間疫苗不能完全交叉保護(hù)，給疫苗研制增加困難.BRV疫苗除美國USDA批準(zhǔn)生產(chǎn)的G6型單價(jià)BRV減毒疫苗外，我國無商品化疫苗.目前國內(nèi)研究者對BRV生物技術(shù)疫苗的探索研發(fā)已取得初步成效，期待研究者借助適配的動物模型加速研究成果轉(zhuǎn)化.