養(yǎng)殖對蝦的主要病毒性疾病及其免疫防控措施（11）

○張喜貴孟長明陳昌福

（1河南省新鄉(xiāng)市康大消毒劑有限公司，河南新鄉(xiāng) 453700；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070）

②生物學(xué)功能Crustins具有抗菌活性和蛋白酶抑制劑活性。在WAP結(jié)構(gòu)域中，N端帶正電荷的氨基酸和疏水性氨基酸的正確定位可使蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出兩性分子特征，而兩性分子蛋白質(zhì)可以插入至微生物細(xì)胞膜中破壞膜結(jié)構(gòu)，從而起到抗菌作用。C端結(jié)構(gòu)域顯示蛋白酶抑制劑活性。與抗菌活性一樣，蛋白酶抑制劑活性在甲殼動物免疫應(yīng)答中起到一定作用，通過參與蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，防止蛋白酶的過量激活，從而避免宿主組織的自身損傷和抵抗病原微生物的感染。

（3）抗脂多糖因子（antilipopolysaccharid factor，ALF）

①種類與結(jié)構(gòu)ALF最初發(fā)現(xiàn)于馬蹄蟹體內(nèi)，是一種具有抗菌作用和結(jié)合脂多糖（LPS）的多肽分子。此后，在白濱對蝦、斑節(jié)對蝦和中國明對蝦中也發(fā)現(xiàn)ALF，并且蝦類ALF與馬蹄蟹ALF具有較高的同源性。ALF的相對分子量約為11.5KDa，由102個氨基酸殘基組成，N端有20個高度疏水性氨基酸，在Cys32-Cys53間形成二硫鍵，二硫內(nèi)有保守的正電荷氨基酸。

②生物學(xué)功能ALF能替換LPS分子中的Ca2＋，然后利用它的正電荷特性，結(jié)合到LPS的磷酸基團和羧基基團上，ALF與LPS結(jié)合后可以阻止啟動炎性細(xì)胞因子的級聯(lián)反應(yīng)，減少組織損傷。此外，LPS是革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，ALF與LPS的毒性成分類脂A結(jié)合后，可破壞內(nèi)毒素的毒性作用。

（4）來自血藍蛋白的抗菌肽

①陰離子抗菌肽Dexstoumieux-Garzon等從細(xì)角濱對蝦（Penaeus stylirostris）和凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）的血淋巴中分離到3種具有抗真菌活性的陰離子抗菌肽。兩種來源于細(xì)角濱對蝦的酸性血漿，相對分子量分別為7.9KDa和8.3KDa，分別命名為 PsHctl和 PsHct2，PsHct1是PsHct2除去了部分殘基所得到的短肽；另一種來源于凡納濱對蝦，相對分子量為2.7KDa，命名為PvHct。3種陰離子抗菌肽與其他類型的抗菌肽沒有序列上的相似性，但與對蝦血藍蛋白的C端氨基酸具有95%～100%的同源性，表明它們是血藍蛋白的裂解片段。陰離子抗菌肽與陽離子抗菌肽最大的區(qū)別是它們在生理pH條件下帶負(fù)電荷，pI為5.65～6.54，分子結(jié)構(gòu)中不包含銅離子結(jié)合位點。通過免疫檢測發(fā)現(xiàn)受真菌感染的甲殼動物血淋巴中的陰離子抗菌肽濃度高于未被感染動物血淋巴中的陰離子抗菌肽濃度，說明陰離子抗菌肽與抗真菌免疫反應(yīng)有關(guān)。同時，通過體外抑菌試驗發(fā)現(xiàn)陰離子抗菌肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均未有抗菌活性，但對真菌顯示出廣譜的抗菌活性。

②Astacidin1Lee等應(yīng)用陽離子交換層析和反相HPLC從淡水小龍蝦（Pacifastacus leniusculus）的血淋巴中分離純化了一種具有16個氨基酸殘基組成的相對分子量為1.95KDa的抗菌肽，并命名為astacidin1。與小龍蝦血藍蛋白序列比較發(fā)現(xiàn)：它也是一種來源于血藍蛋白C端的抗菌肽，但與同樣來源于血藍蛋白C端的3種陰離子抗真菌肽無同源性。astacidin1的一級結(jié)構(gòu)序列為FKVQNQHGQVVKIFHH-COOH，不含糖殘基及半胱氨酸殘基。astacidin1的二級結(jié)構(gòu)中含有一個B-折疊結(jié)構(gòu)。Astacidin1對革蘭氏陽性和陰性菌均具有抗菌活性，但切去其氨基端后，抗菌活性明顯降低，說明astacidin1的氨基端部分是具有抗菌活性的主要區(qū)域。此外，脂多糖或葡聚糖可以刺激螯蝦血藍蛋白產(chǎn)生astacidin1。

③來自血藍蛋白抗菌肽的產(chǎn)生機制已有研究表明，許多抗菌肽都是由較大的前體蛋白加工后形成的。如蟾蜍素I是從亞洲蟾蜍胃腺細(xì)胞中的組蛋白H2A經(jīng)胃蛋白酶水解而形成的。從牛蜱腸中分離得到的一種3.2KDa抗菌肽是牛血紅蛋白的分解片段。此外，用人胃蛋白酶裂解牛乳鐵蛋白（Lactoferrin）后產(chǎn)生了具有更高抗菌活性的Lactoferricins片段。這說明金屬結(jié)合蛋白能通過蛋白酶水解作用產(chǎn)生抗菌肽而參加免疫防御反應(yīng)，也為來自血藍蛋白的甲殼動物抗菌肽的發(fā)現(xiàn)提供了一個佐證，因為它們是由結(jié)合銅的血藍蛋白產(chǎn)生的。

對蝦遭受病原微生物感染后，其血淋巴中可檢測到高濃度的PvHct，說明血藍蛋白的裂解不是由于抽提過程造成的，而是由生物學(xué)信號所引起的。雖然血藍蛋白的加工機制還不清楚，但推測它很可能是被來源于血細(xì)胞的酶所驅(qū)動的，因為甲殼動物在遭受病原微生物感染后，血細(xì)胞發(fā)生胞吐作用，胞吐作用有助于血藍蛋白裂解酶的釋放，從而使PvHct的濃度增加。astacidin1也是經(jīng)過半胱氨酸樣蛋白酶對血藍蛋白加工而形成的。因此，加深對這些酶的研究有助于揭示甲殼動物的免疫應(yīng)答機制以及血藍蛋白在防御中所起的作用。

（未完待續(xù)）