高通量測(cè)序在肝硬化患者腹水、血清及糞便微生物群檢測(cè)中的應(yīng)用

李 真， 張 維， 賈 琳， 胡中杰

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 肝病重癥醫(yī)學(xué)科， 北京 100071

二代測(cè)序，又稱高通量測(cè)序，是對(duì)一個(gè)物種的幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)DNA分子基因組和轉(zhuǎn)錄組同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)生物信息學(xué)分析鑒定出標(biāo)本中所含核酸的種類, 并可獲得該物種的序列數(shù)、覆蓋度等定量分析數(shù)據(jù)，從而全面分析該物種。二代測(cè)序具有檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確率高、成本低、覆蓋面廣以及產(chǎn)出巨大等特點(diǎn)[1]。目前，二代測(cè)序在醫(yī)學(xué)方面已經(jīng)運(yùn)用于腫瘤、寄生蟲(chóng)病、遺傳病、基因水平檢測(cè)等多種疾病的檢測(cè)、預(yù)防及治療[1]，該技術(shù)也有助于肝硬化患者并發(fā)感染的診治，值得進(jìn)一步關(guān)注。

臨床上，肝硬化患者極易發(fā)生細(xì)菌感染，感染發(fā)生率是一般人群的4～5倍[2]，尤其是住院患者，其細(xì)菌感染發(fā)生率高達(dá)25%～40%[3]，臨床以自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis，SBP)最為多見(jiàn)[4]。感染是肝硬化患者常見(jiàn)的并發(fā)癥及常見(jiàn)死亡原因之一[5]。肝硬化患者感染癥狀隱匿，對(duì)于懷疑感染者必須盡早進(jìn)行病原學(xué)檢查，以便獲得藥敏結(jié)果以指導(dǎo)臨床治療，降低病死率。SBP的診斷和治療是臨床實(shí)踐中的難點(diǎn)，因此需引入新的診療體系。值得關(guān)注的是，人體腸道微生物群構(gòu)成了一個(gè)穩(wěn)態(tài)平衡、共生生態(tài)系統(tǒng)[6]。雖然已有研究[7]發(fā)現(xiàn)人類疾病與腸道微生物的多樣性、數(shù)量以及豐度分布相關(guān)，但其因果關(guān)系尚不明確，需要更深入的研究。亦有研究[8]表明，肝硬化的發(fā)展可能與腸道微生物群結(jié)構(gòu)變化有關(guān)?，F(xiàn)就二代測(cè)序在肝硬化方面的應(yīng)用綜述如下。

1 二代測(cè)序在肝硬化腹水微生物群的應(yīng)用

目前，臨床上常規(guī)應(yīng)用腹水細(xì)菌培養(yǎng)方法獲得SBP致病菌，但細(xì)菌培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，且因大量腹水的稀釋以及預(yù)防性廣譜抗生素的應(yīng)用，導(dǎo)致腹水培養(yǎng)陽(yáng)性率為10%～60%[9]。此外，細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)無(wú)法檢測(cè)出苛養(yǎng)菌、胞內(nèi)菌、病毒等病原體[10]。二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)為腹水病原學(xué)診斷提供了一種更為精準(zhǔn)的方法[1,11]。2015年，F(xiàn)eng等[12]通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)和16sPCR方法，對(duì)有或無(wú)SBP的肝硬化腹水患者進(jìn)行腹水菌群鑒定，發(fā)現(xiàn)在同一個(gè)標(biāo)本中二代測(cè)序?qū)τ诩?xì)菌DNA分子更敏感，即使是低豐度細(xì)菌也能夠識(shí)別。在這些檢測(cè)標(biāo)本中，大腸桿菌占所有檢測(cè)細(xì)菌豐度的一半以上，革蘭陽(yáng)性菌感染呈上升趨勢(shì)。該研究表明，二代測(cè)序技術(shù)是鑒定肝硬化腹水或其他低豐度細(xì)菌DNA標(biāo)本微生物學(xué)的有力方法。此外，Engelmann等[3]收集173例失代償期肝硬化患者的腹水樣本，采用定量PCR及二代測(cè)序(Ripseq測(cè)序平臺(tái))對(duì)細(xì)菌DNA陽(yáng)性的腹水樣本進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞性腹水和非白細(xì)胞性腹水檢測(cè)出細(xì)菌DNA的概率相近(40% vs 43.5%)，且腹水細(xì)菌DNA水平>520 拷貝/ml患者的30、180 d存活率大大降低；而腹水細(xì)菌DNA水平>5000 拷貝/ml的患者預(yù)后最差。上述研究表明，患者的生存率與腹水細(xì)菌DNA水平顯著相關(guān)。同時(shí)，進(jìn)一步通過(guò)Ripseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌DNA陽(yáng)性腹水樣本測(cè)序，發(fā)現(xiàn)腹水細(xì)菌譜主要是革蘭陽(yáng)性菌株[13]，該研究結(jié)果與近年來(lái)腹水細(xì)菌DNA的檢測(cè)結(jié)果是一致的，即83.8%的檢測(cè)細(xì)菌是革蘭陽(yáng)性菌[14]。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，近年來(lái)革蘭陽(yáng)性腹水感染逐漸在增加。因此，近年來(lái)有學(xué)者建議將細(xì)菌DNA檢測(cè)作為細(xì)菌易位的標(biāo)志。通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)腹水中的細(xì)菌DNA，發(fā)現(xiàn)腹水中的細(xì)菌不僅僅可以來(lái)自腸道，也可來(lái)自皮膚定植菌[15]，或者菌血癥患者血液中的細(xì)菌[16]。Rogers等[15]選取25例肝硬化腹水的患者，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)腹水標(biāo)本中總細(xì)菌載量進(jìn)行定量，并進(jìn)一步應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒定細(xì)菌種類和相對(duì)豐度，發(fā)現(xiàn)腹水標(biāo)本中除了腸道相關(guān)的菌群，還有其他許多非腸道微生物，如機(jī)會(huì)性感染相關(guān)的需氧菌屬，包括不動(dòng)桿菌、假單胞菌、拉爾斯頓菌、寡養(yǎng)單胞菌和葡萄球菌；也有來(lái)自于皮膚定植菌，如丙酸桿菌屬。由此可見(jiàn)，治療SBP患者選擇抗生素時(shí)具有一定困難，一般抗生素不可能覆蓋如此廣泛的微生物種類。因此，利用二代測(cè)序技術(shù)更加準(zhǔn)確快速檢測(cè)腹水主要致病菌，指導(dǎo)臨床抗生素治療，對(duì)提高患者生存率至關(guān)重要。

2 二代測(cè)序在肝硬化血清微生物群的應(yīng)用

既往研究多應(yīng)用傳統(tǒng)的PCR技術(shù)檢測(cè)肝硬化患者血標(biāo)本中的微生物，但是檢測(cè)率低，且檢測(cè)到的大多數(shù)細(xì)菌十分單一，多為大腸桿菌或金黃色葡萄球菌[17]。Santiago等[18]通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)對(duì)7例健康對(duì)照者與27例肝硬化患者的血清微生物標(biāo)本組進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)也對(duì)比分析11例肝硬化腹水患者的腹水和血清微生物標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在肝硬化患者的血清和腹水中均能檢測(cè)到復(fù)雜且特異的微生物群落，以厚壁菌和擬桿菌最豐富，而健康對(duì)照組的血清標(biāo)本中幾乎檢測(cè)不到。與不伴有腹水的肝硬化患者相比，肝硬化腹水患者血清中以梭菌屬最具有多樣性，且相對(duì)豐度較高，通過(guò)β-多樣性分析發(fā)現(xiàn)血清和腹水標(biāo)本中微生物組成相似。同樣，該研究表明，相較于無(wú)腹水的患者，肝硬化腹水患者的炎癥狀態(tài)明顯增加。有趣的是，Caro等[19]通過(guò)對(duì)77例肝硬化腹水患者的血清和腹水標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌DNA測(cè)序，鑒定細(xì)菌種類，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌易位的細(xì)菌類型(革蘭陰性或革蘭陽(yáng)性細(xì)菌)對(duì)于炎癥反應(yīng)影響程度不同，當(dāng)其血清和腹水中存在革蘭陰性菌DNA時(shí)，炎癥因子TNFα、IFNγ和NO濃度較高；且TNFα水平與細(xì)菌DNA濃度和脂多糖(LPS)呈顯著相關(guān)。而NO濃度與細(xì)菌DNA濃度顯著相關(guān)，但與LPS水平無(wú)關(guān)；INFγ和IL-12的水平與細(xì)菌DNA和LPS水平均無(wú)顯著相關(guān)性。結(jié)果表明，血漿中的細(xì)菌DNA濃度是與炎癥反應(yīng)最準(zhǔn)確相關(guān)的因素。因此，對(duì)肝硬化感染高風(fēng)險(xiǎn)患者使用諾氟沙星初步預(yù)防，不僅可以顯著降低SBP的發(fā)生率，也可降低肝腎綜合征的發(fā)生率[16]。此外，肝硬化患者若存在菌血癥，微生物可以通過(guò)非細(xì)菌易位途徑，轉(zhuǎn)移至腹腔，從而導(dǎo)致SBP的發(fā)生。有研究[15]在有寵物接觸史的SBP患者腹水中發(fā)現(xiàn)有巴氏菌、蠟樣芽孢桿菌，表明肝硬化患者若存在菌血癥，也可能導(dǎo)致腹水感染。

綜上所述，通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)分析肝硬化并發(fā)SBP患者血液的微生物組學(xué)特征，同時(shí)引入同源性分析，從宏基因組學(xué)方面深入探究細(xì)菌易位的方式，有助于闡明SBP的發(fā)生機(jī)制。同時(shí)，通過(guò)表征SBP微生物組學(xué)特征，有助于指導(dǎo)臨床抗菌藥物的選擇和精準(zhǔn)抗感染治療。

3 二代測(cè)序在肝硬化糞便微生物群的應(yīng)用

肝硬化患者若合并門靜脈高壓癥，因膽汁酸分泌減少、門靜脈高壓、腸黏膜屏障受損，腸道黏膜上皮通透性增加[20]，影響腸道微生物群的組成和生長(zhǎng)。腸道微生態(tài)失調(diào)與肝硬化的發(fā)病機(jī)制及終末期肝病的發(fā)生發(fā)展存在因果關(guān)系[21]。大多數(shù)腸道細(xì)菌無(wú)法直接培養(yǎng)，難以對(duì)其進(jìn)行全面分析。二代測(cè)序技術(shù)解決了這一難題，使得對(duì)微生物的多樣性分辨及物種的定性、定量分析成為可能[22]。更多的二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，肝硬化患者的腸道微生物群發(fā)生變化，對(duì)肝臟有益的微生物群相對(duì)減少，但致病類微生物群(如葡萄球菌科、腸桿菌科和腸球菌科)相對(duì)過(guò)度生長(zhǎng)[23]，表明腸道微生物菌群的變化是肝硬化患者病情進(jìn)展程度相關(guān)的獨(dú)立因子[24]。Chen等[25]收集36例肝硬化患者和24例健康人群的糞便微生物標(biāo)本，對(duì)16S核糖體RNA V3區(qū)域采用454焦磷酸測(cè)序，分析糞便微生物群，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的糞便微生物群落潛在致病細(xì)菌(如腸桿菌科、鏈球菌科)增多，有益細(xì)菌(如雙歧桿菌、毛螺菌)減少；Child-Turcotte-Pugh評(píng)分與鏈球菌科呈正相關(guān)，與螺菌科呈負(fù)相關(guān)，提示腸道微生物群的改變可能影響肝硬化患者的預(yù)后。該研究結(jié)論也被其他團(tuán)隊(duì)的研究驗(yàn)證，如Qin等[26]通過(guò)定量宏基因組學(xué)分析了肝硬化患者的腸道微生物群，表明肝硬化的發(fā)展可能與腸道微生物群結(jié)構(gòu)變化有關(guān)；Wei等[27]采用高通量Solexa測(cè)序分析糞便中微生物群落和功能，發(fā)現(xiàn)腸道菌群的改變與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[28]。Santiago等[18]采用16S核糖體DNA高通量測(cè)序?qū)?7例肝硬化患者與17例健康對(duì)照人群的糞便微生物組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)健康人群的糞便微生物群落較肝硬化患者具有更高的多樣性，提出血清和糞便微生物組成的改變可作為肝硬化進(jìn)展的指標(biāo)。Rogers等[14]對(duì)25例肝硬化腹水患者，通過(guò)焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒定細(xì)菌種類及相對(duì)豐度，發(fā)現(xiàn)在肝硬化患者的腸道菌群中，以變形菌門最多(53.9%)，其次是厚壁菌門(21.2%)、放線菌門(17.4%)和擬桿菌門(4.4%)。而健康個(gè)體的腸道菌群以擬桿菌門和厚壁菌門為主，肝硬化患者的腸道菌群中，擬桿菌門的相對(duì)豐度下降，變形桿菌和梭菌門的相對(duì)豐度增加，其中鏈菌科的增加與肝硬化嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)趨勢(shì)。研究[29]表明，腸道菌群變化可以提示肝硬化進(jìn)展，且在此研究基礎(chǔ)上，可以通過(guò)關(guān)注腸道微生物群的變化幫助研發(fā)新的治療肝硬化的方案，以腸道微生物作為慢性肝病治療靶向。

4 二代測(cè)序目前的挑戰(zhàn)

目前，二代測(cè)序技術(shù)在病原學(xué)診斷方面顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其快速、精準(zhǔn)的特性很好地補(bǔ)充了病原學(xué)診斷方法。然而，對(duì)于一些胞壁較厚，難裂解的真菌或細(xì)菌，二代測(cè)序在測(cè)序時(shí)存在一定的假陰性[30]。此外，測(cè)序覆蓋度與病原體基因組大小有關(guān)，病毒的測(cè)序覆蓋度遠(yuǎn)高于細(xì)菌、真菌及寄生蟲(chóng)，測(cè)序時(shí)可能導(dǎo)致致病菌判斷失誤或遺漏[31]。并且，二代測(cè)序在正常健康人血液和糞便中可以檢測(cè)到多種微生物的存在，肝硬化患者亦如此。因此，判斷測(cè)序檢出的微生物為致病菌還是污染菌極為重要。其測(cè)序結(jié)果的判讀往往還需要與臨床相結(jié)合，目前為止尚未單獨(dú)依靠測(cè)序結(jié)果判斷污染菌或致病菌，這是二代測(cè)序的局限性。二代測(cè)序是基于對(duì)標(biāo)本的游離DNA檢測(cè)，但死菌釋放的游離DNA也是可檢測(cè)的，若患者接受抗生素治療[32]或合并創(chuàng)傷、腫瘤[33]，其測(cè)序結(jié)果也會(huì)隨之被影響。Rogers等[34]在提取DNA之前，采用疊氮溴化丙錠預(yù)處理標(biāo)本可以清除死菌釋放的游離DNA，雖然此方法未經(jīng)過(guò)其他研究驗(yàn)證，但仍值得參考。二代測(cè)序是提取標(biāo)本中的全部核酸片段加以檢測(cè)，理論上可以檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的核酸序列。但是往往測(cè)序結(jié)果只能達(dá)到鑒別微生物種屬的級(jí)別[35]，并不能全面檢測(cè)耐藥基因。因此，治療時(shí)抗生素選擇還是要靠臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)。上述問(wèn)題均需要日后更為深入的研究、探索。但可以肯定的是，隨著測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，在未來(lái)幾年內(nèi)臨床測(cè)序應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。