植物組織培養(yǎng)污染成因分析及防控措施

梁明驊 曾雯雯 陸耀

(廣西玉林農(nóng)業(yè)學(xué)校，廣西 玉林 537000)

植物組織培養(yǎng)是指在無菌環(huán)境下由人工控制植物的器官、組織、細胞及原生質(zhì)體，將其與植物體分離后利用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，使之繼續(xù)生長并發(fā)育成完整植株的過程。植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以有效縮短植物的生長周期，減少生產(chǎn)成本，而且人工控制的培養(yǎng)條件為植物提供了優(yōu)良的生長環(huán)境，可以有效避免外部因素對植物生長的影響。植物組織培養(yǎng)技術(shù)雖然擁有眾多優(yōu)勢，但在培養(yǎng)過程中經(jīng)常會產(chǎn)生污染，這種污染不易控制，一旦某個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題就容易使植物組織產(chǎn)生污染，進而導(dǎo)致整個實驗失敗。所以要想減少培養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟效益，就要做好植物組織培養(yǎng)污染的防控工作。

1 植物組織培養(yǎng)污染的概念

植物組織培養(yǎng)始于20世紀初,是以植物生理學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的植物種苗繁殖技術(shù)。經(jīng)過近1個世紀的發(fā)展,植物組織培養(yǎng)技術(shù)已在科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐上得到了廣泛應(yīng)用,特別是在植物的工廠化育苗方面。植物組織中含有大量的微生物，其特點是繁殖速度快，生長周期短。當(dāng)植物組織進行長時間離體培養(yǎng)時就會出現(xiàn)污染現(xiàn)象，植物組織培養(yǎng)的操作并不復(fù)雜，但稍加疏忽就會引起組織培養(yǎng)的污染。這些污染通常出現(xiàn)在培養(yǎng)基附近，呈現(xiàn)出各種不同形狀大小的痕跡，如霉變、云霧狀、發(fā)酵泡沫狀等。植物組織培養(yǎng)中的污染可能來自于內(nèi)部因素，如真菌、細菌、酵母菌等多種微生物，也有可能來自于外部因素，如操作人員在操作過程中沒有按照標(biāo)準(zhǔn)進行操作等。總之，植物組織在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生污染的原因有很多，操作人員需要根據(jù)具體情況來分析，然后采取相應(yīng)的防控措施。

2 防控污染的意義

植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生的污染有著很大危害性。對植物組織培養(yǎng)有一定阻礙，如增殖速度降低、生長速度減緩等，嚴重情況下會導(dǎo)致植物死亡，培養(yǎng)實驗失敗，從而增加培養(yǎng)成本，降低企業(yè)的經(jīng)濟利益。防控污染可以有效促進植物組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進展，構(gòu)建完整的植物試管基因庫，保護培養(yǎng)實驗過程中寶貴的樣本數(shù)據(jù)，避免受到污染的危害。另外，植物組織培養(yǎng)中含有大量的珍稀物種，這些物種的價值很高且獲得不易，降低組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)的污染，可以起到保護珍稀物種的作用。由此可見，防控污染的意義重大，政府、相關(guān)部門及操作人員要重視植物組織培養(yǎng)過程中的防控工作，加大研究力度，改善操作的不足之處，科學(xué)合理地開展植物組織培養(yǎng)工作。

3 植物組織培養(yǎng)污染的種類

3.1 材料帶菌

材料帶菌是指植物組織從植物體分離時就帶有病菌，這些病菌可能來自于植物體的生長環(huán)境，通常情況下植物體的生長環(huán)境中都含有大量的微生物，因為其溫度、濕度可以滿足微生物的生長條件，一般病菌會分布在植物體的表面或周圍。

3.2 初代培養(yǎng)污染

初代培養(yǎng)污染是指在進行第1代植物組織培養(yǎng)時產(chǎn)生的污染菌。這種污染出現(xiàn)的原因多是由于操作人員在進行實驗操作時沒有按照標(biāo)準(zhǔn)要求進行操作，導(dǎo)致病原菌接種在培養(yǎng)基上，經(jīng)過幾天以后病原菌就會在植物體附近大量繁殖，從而造成病原菌污染。初代培養(yǎng)污染一旦產(chǎn)生就會給實驗造成嚴重影響，因為這種污染不好控制，清理過程較為復(fù)雜，所以操作人員要嚴加防控初代培養(yǎng)污染現(xiàn)象的產(chǎn)生。

3.3 繼代培養(yǎng)污染

繼代培養(yǎng)是指當(dāng)植物組織在培養(yǎng)基里生長了一段時間后，培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生枯竭，無法滿足植物的生長需求，因此就需要將植物組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上。在植物組織轉(zhuǎn)移的過程中原本沒有病原菌污染的植物種苗也容易受到危害，培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)的病原菌會感染到植物種苗上，從而產(chǎn)生污染現(xiàn)象[1]。

4 植物組織培養(yǎng)污染的成因分析

4.1 病原菌的分析

造成植物組織培養(yǎng)污染的主要來源是病原菌，其中包含細菌、真菌、酵母菌及防線菌等。細菌污染通常在接種后1～2d就會在培養(yǎng)基周圍出現(xiàn)大量粘液狀和發(fā)酵泡沫狀的物體，這種病原菌耐高溫高壓，不易清除。真菌污染是由霉菌引發(fā)的，在培養(yǎng)基上接種5d左右會出現(xiàn)多種顏色的菌斑。

4.2 外植體的分析

外植體培養(yǎng)是指將植物組織與植物體進行分離后，在植物體外進行培養(yǎng)工作。外植體的選擇對植物組織培養(yǎng)有著關(guān)鍵性的作用，因為外植體攜帶的病原菌不易清除，會污染材料內(nèi)部，容易造成培養(yǎng)過程中的污染。操作人員在取材外植體時要考慮到氣候等環(huán)境條件，一般植物莖尖處含有的病原菌較少，并且具有生長速度快、遺傳穩(wěn)定性強的優(yōu)勢，因此選擇莖尖部位可以達到良好的培養(yǎng)效果。

根據(jù)外植體的取材地點和生長時期來說，要避免采集生長環(huán)境惡劣的植物體，植株越深入地下受到的病菌感染就越小。另外，還要避免采集成年或衰老的植物體，這類植株生長速度慢，新陳代謝功能差，容易遭受病原菌的感染。因此，在采集外植體時要進行多方面的考慮，盡量選取生長時期適合、不易被感染的植株進行培養(yǎng)實驗[2]。

4.3 培養(yǎng)條件的分析

培養(yǎng)室的環(huán)境條件與污染率有著很大的關(guān)聯(lián)，如果培養(yǎng)室的溫度適宜、濕度較大，就會給病原菌提供有利的生長條件，從而產(chǎn)生較高的污染概率。植株自身生長環(huán)境的優(yōu)劣也會影響組織培養(yǎng)過程的病菌污染率，操作人員在選取時要注重其生長環(huán)境，盡量選取光照充足處的外植體。培養(yǎng)基是繁殖病原菌的主要場所，培養(yǎng)基內(nèi)不宜添加過多有利于病原菌生長的有機成分，且培養(yǎng)基要滅菌到位，合理控制培養(yǎng)基內(nèi)部的溫度、濕度及pH值，為植物組織的健康生長提供優(yōu)良的環(huán)境條件。

4.4 操作人員的分析

培養(yǎng)過程中的污染多是來自于人為因素，操作人員只要嚴格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進行操作，就可以有效避免污染現(xiàn)象的產(chǎn)生。人為污染的主要表現(xiàn)有以下幾點：操作人員在進行接種工作時沒有管理好自身的行為，不及時清洗、消毒自身的衣物，將細菌、霉菌帶入無菌培養(yǎng)室內(nèi)，從而造成污染；工具存放不當(dāng)或滅菌不到位，植物組織培養(yǎng)的過程中需要使用大量的工具，如鑷子、器皿、剪子、刀、培養(yǎng)皿等，如果操作人員使用完畢后沒有及時清理保存，且使用前未充分滅菌，在下次使用時就會對植株造成污染。

5 植物組織培養(yǎng)污染的防控措施

5.1 選取適宜的外植體

植物組織培養(yǎng)污染防控工作要從外植體采集源頭開始，不同環(huán)境下外植體的帶菌程度不同，選擇適宜的外植體，避免采集帶菌量多的植株，可以有效減少組織培養(yǎng)過程中的污染。通常優(yōu)良的外植體一般生長在光照充足的環(huán)境下，因此夏季是選取外植體的適宜季節(jié)，高溫可以殺死大量的微生物和病菌，能夠最大程度減少外植體本身攜帶的污染。

5.2 外植體滅菌處理

目前，在植物組織培養(yǎng)中普遍使用的滅菌處理方法有抗生素處理法、低溫處理法、減壓滅菌處理法等。其中，抗生素處理法是指當(dāng)植物組織受到嚴重污染時采用抗生素進行噴灑，可以有效達到滅菌處理的目的。低溫處理法將培養(yǎng)對象置于低溫環(huán)境中，使部分病原菌不能存活，不過此類方法不適用于所有的植物體。減壓滅菌處理的工作原理是通過減壓操作吸取植物組織中的氣體，使消毒劑進入到組織內(nèi)部中，從而達到滅菌處理的效果[3]。

5.3 培養(yǎng)條件的控制

造成組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生污染，多數(shù)情況下是操作人員沒有控制好培養(yǎng)條件。在培養(yǎng)基方面，操作人員要嚴格進行滅菌工作，防止滅菌不徹底造成病原菌繁殖的現(xiàn)象，并且要及時去除培養(yǎng)基中的有機成分，有機成分是提供微生物生存的有利條件，去除有機成分可以大大減少污染率。另外，在選取培養(yǎng)容器時要盡量選擇密封性能良好、體積較小的容器，因為此類容器可以有效減少污染產(chǎn)生的可能性。

5.4 嚴格按照標(biāo)準(zhǔn)操作

操作人員要意識到標(biāo)準(zhǔn)操作的重要性，嚴格規(guī)范自身的行為，定期清理消毒衣物和鞋子，避免攜帶病原菌進入無菌接種和培養(yǎng)室內(nèi)。并且要保證工作臺處于嚴格的無菌狀態(tài)，在接種后及時做好衛(wèi)生工作，可以用新潔爾滅溶液進行地面、墻壁和門窗的消毒，尤其要注意容器檢查，避免出現(xiàn)容器密封不嚴或破損的現(xiàn)象。