細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法在創(chuàng)面修復(fù)研究中的應(yīng)用

姜 艷 卓臣義 岑小寧 唐 強(qiáng) 唐習(xí)強(qiáng) 韋 騁 唐乾利

作者單位： 530004 廣西 南寧， 廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心／右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心（姜艷）； 533000 廣西 百色，右江民族醫(yī)學(xué)院／桂西高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（卓臣義， 岑小寧， 唐強(qiáng)， 唐習(xí)強(qiáng)， 韋騁， 唐乾利）

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為， 慢性難愈合創(chuàng)面屬于“潰瘍”范疇， 可由一種或多種因素誘發(fā)， 具有治愈困難、發(fā)病率高、 治療費(fèi)用高昂等特點(diǎn)。 流行病學(xué)研究資料顯示， 慢性難愈合創(chuàng)面的發(fā)病率為1% ～2%［1］，且以糖尿病足、 壓瘡、 下肢靜脈性潰瘍最為常見(jiàn)，已成為臨床研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。 筆者認(rèn)為， 應(yīng)用科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)方法探究慢性難愈合創(chuàng)面修復(fù)的細(xì)胞生物學(xué)作用機(jī)制對(duì)提高慢性難愈合創(chuàng)面的防治效果具有重要意義， 遂于本研究中對(duì)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法在創(chuàng)面修復(fù)研究中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述， 以期為慢性難愈合創(chuàng)面的臨床治療提供參考。

1 創(chuàng)面修復(fù)及細(xì)胞生物學(xué)概述

1.1 創(chuàng)面修復(fù)概述

創(chuàng)面修復(fù)是指皮膚組織損傷后通過(guò)自身組織再生、 重建或人為干預(yù)而愈合的過(guò)程［2］。 創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程復(fù)雜、 連續(xù)且受全身反應(yīng)調(diào)節(jié)， 不僅關(guān)系到局部創(chuàng)面， 同時(shí)也與身體整體機(jī)能息息相關(guān)。 目前， 相關(guān)研究證實(shí)， 創(chuàng)面修復(fù)主要包含炎癥期、 增生期、組織重建期3 個(gè)階段， 涉及多種特定細(xì)胞的行為、形態(tài)、 功能等生物學(xué)變化， 如炎癥期主要為血液凝固及炎癥細(xì)胞遷移， 增生期主要為角質(zhì)細(xì)胞、 纖維母細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、 增殖、 分化以促進(jìn)新生血管、 肉芽組織形成及創(chuàng)面再上皮化， 組織重建期主要為細(xì)胞外基質(zhì)的成熟及組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)［3］。

1.2 細(xì)胞生物學(xué)概述

細(xì)胞生物學(xué)是以細(xì)胞為研究對(duì)象， 在顯微、 亞顯微和分子水平研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、 功能， 分析細(xì)胞間的相互作用以及各種干預(yù)手段對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制，從而了解生物體的生長(zhǎng)、 發(fā)育、 分化、 繁殖、 運(yùn)動(dòng)、 遺傳、 變異、 衰老、 病變和死亡等生命規(guī)律的科學(xué)。 近年來(lái)， 細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展迅速， 與分子生物學(xué)、 神經(jīng)生物學(xué)和生態(tài)學(xué)并列為生命科學(xué)的四大基礎(chǔ)學(xué)科。 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法包括細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)觀察、 細(xì)胞化學(xué)分析、 細(xì)胞生理學(xué)、 細(xì)胞工程等30 多種， 適用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究的各個(gè)領(lǐng)域， 特別是細(xì)胞生物學(xué)具有研究對(duì)象專一性、 影響因素可控性、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容獨(dú)特性等特點(diǎn)， 結(jié)合創(chuàng)面修復(fù)特征，通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法研究創(chuàng)面組織細(xì)胞的行為、 功能、 形態(tài)等特性， 可為創(chuàng)面修復(fù)的相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)支持。

2 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)在創(chuàng)面修復(fù)研究中的應(yīng)用

2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

創(chuàng)面修復(fù)炎癥期巨噬細(xì)胞、 中性粒細(xì)胞、 淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞參與了創(chuàng)面壞死組織及炎癥細(xì)胞的清除， 增生期血管內(nèi)皮細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞、 上皮細(xì)胞、 表皮細(xì)胞等參與了新生血管的形成及創(chuàng)面的收縮和再上皮化， 重塑期成纖維細(xì)胞、 上皮細(xì)胞等參與了組織結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定［1］。 在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中， 可采用創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中所涉及的各類細(xì)胞的原代培養(yǎng)細(xì)胞株或連續(xù)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

2.1.1 原代細(xì)胞 原代細(xì)胞是從機(jī)體取出后分散成單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞， 因其離體時(shí)間較短， 故遺傳性狀和體內(nèi)細(xì)胞相近， 可用于細(xì)胞形態(tài)、 功能和增殖分化的研究， 如可采用原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞［3］、 成纖維細(xì)胞［4-5］、 上皮細(xì)胞、 血管內(nèi)皮細(xì)胞［6］研究創(chuàng)面修復(fù)增生期的部分作用機(jī)制。

2.1.2 傳代細(xì)胞 因原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程繁瑣、 細(xì)胞狀態(tài)多變、 實(shí)驗(yàn)成本較高及易發(fā)生生長(zhǎng)停滯、 細(xì)胞衰老死亡等特點(diǎn)， 實(shí)際操作中多選擇傳代細(xì)胞進(jìn)行研究，如可用于創(chuàng)面修復(fù)、 角質(zhì)形成細(xì)胞上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT） 研究的人永生化表皮細(xì)胞系HaCaT 細(xì)胞［7］具有與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞同等的分化特性， 可繁殖150 代以上，且不具有腫瘤特性； 人成纖維細(xì)胞系HFF、 MSU-1.1細(xì)胞可用于細(xì)胞纖維化及其產(chǎn)物變化的研究［6］； 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系BalB／3T3 和NIH／3T3 細(xì)胞可用于細(xì)胞纖維化及基因轉(zhuǎn)染與基因表達(dá)的研究［8］。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 細(xì)胞生物學(xué)行為研究 細(xì)胞具有增殖、 凋亡、 遷移等多種行為， 均可用于創(chuàng)面的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究， 如創(chuàng)面修復(fù)炎癥期中性粒細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞向受損部位遷移； 增生期成纖維細(xì)胞大量增殖、 合成并分泌膠原纖維和基質(zhì)成分， 與新生毛細(xì)血管共同形成肉芽組織， 填補(bǔ)缺損創(chuàng)面［9］， 此過(guò)程中若成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖， 可形成淺表性瘢痕、 增生性瘢痕甚至瘢痕疙瘩［10］。 可通過(guò)特定蛋白檢測(cè)、 細(xì)胞代謝活性及ATP 含量檢測(cè)、 活細(xì)胞熒光標(biāo)記等方法研究細(xì)胞的增殖情況， 通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)［11］、 Transwell 實(shí)驗(yàn)［12］、 實(shí)時(shí)細(xì)胞追蹤實(shí)驗(yàn)等研究創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞、 表皮細(xì)胞的遷移行為。

2.2.2 細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)研究 越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)， 創(chuàng)面細(xì)胞表型的改變可影響細(xì)胞的增殖， 進(jìn)而影響創(chuàng)面修復(fù)［13］， 如炎癥期巨噬細(xì)胞發(fā)生極化，細(xì)胞表型可變?yōu)榫哂写傺滋匦缘腗1 型， 以及具有抑炎特性的M2 型， 兩者作用截然相反， 通過(guò)兩者含量比例控制創(chuàng)面的炎癥走向［14］； 創(chuàng)面重塑期成纖維細(xì)胞可通過(guò)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞表型而影響組織的致密性和創(chuàng)面的收縮性［15］， 導(dǎo)致瘢痕的形成。 通過(guò)藥物刺激、 熒光標(biāo)記、 基因干擾、 激光掃描、 透射電鏡掃描、 免疫組化等多種實(shí)驗(yàn)方法觀察創(chuàng)面相關(guān)細(xì)胞的形態(tài)、 表型、 結(jié)構(gòu)等， 以預(yù)測(cè)創(chuàng)面的發(fā)展方向［16-17］。

3 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)示例

近年來(lái)， 皮膚再生醫(yī)療技術(shù)（moist exposed burn therapy／moist exposed burn ointment， MEBT／MEBO）被廣泛應(yīng)用于慢性難愈合創(chuàng)面的治療， 且唐乾利等研究學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了多項(xiàng)綜合臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究， 結(jié)果證實(shí)其可改善表皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)， 影響細(xì)胞增殖和遷移［18-19］， 并可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)， 調(diào)控血管新生等［20-24］， 因此， 可以MEBT／MEBO為例探討細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的具體應(yīng)用。 如為研究MEBT／MEBO 對(duì)表皮細(xì)胞增殖與遷移行為的影響， 可通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察MEBO 作用后的人永生化表皮細(xì)胞系HaCaT 細(xì)胞或原代成纖維細(xì)胞的變化情況； 為明確MEBT／MEBO 對(duì)細(xì)胞纖維化的影響， 可通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MEBO 干預(yù)后的成纖維細(xì)胞系HFF 細(xì)胞的纖維化產(chǎn)物變化情況。

4 小結(jié)與展望

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)可通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、 結(jié)構(gòu)與功能等的研究探索創(chuàng)面修復(fù)規(guī)律， 且細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法較多， 不僅能夠研究創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中表皮細(xì)胞增殖、 分化等的生物學(xué)行為， 而且還可通過(guò)不同信號(hào)通路及其交互作用研究某種藥物或技術(shù)在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的分子生物學(xué)作用機(jī)制， 為部分醫(yī)療技術(shù)的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。