結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測(cè)試劑相關(guān)問(wèn)題探討

劉容枝 方麗 徐超

作者單位：國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心，北京100081

世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）2017年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，中國(guó)結(jié)核病患者的例數(shù)位居世界第三，并且是世界三大耐多藥結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一。耐藥結(jié)核病指由耐藥結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)是確診耐藥結(jié)核病的唯一方法，但其周期長(zhǎng)，容易延誤治療?；诜肿由飳W(xué)方法的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測(cè)試劑（以下簡(jiǎn)稱(chēng)基因藥敏試驗(yàn)）可快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因組中與特定耐藥相關(guān)的基因突變，較快確定患者對(duì)某種特定結(jié)核藥物的耐藥性［1-3］。

筆者長(zhǎng)期從事結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測(cè)試劑的技術(shù)審評(píng)工作。在本文中，筆者將總結(jié)分析該類(lèi)試劑的臨床應(yīng)用價(jià)值和注冊(cè)情況，同時(shí)對(duì)該類(lèi)試劑設(shè)計(jì)研發(fā)時(shí)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注的產(chǎn)品設(shè)計(jì)、主要原材料選擇和性能評(píng)估等技術(shù)問(wèn)題進(jìn)行探討，以期對(duì)生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行相關(guān)試劑的注冊(cè)申報(bào)進(jìn)行技術(shù)指導(dǎo)。

1 該類(lèi)試劑的臨床使用場(chǎng)景

在臨床實(shí)踐中，臨床機(jī)構(gòu)使用該類(lèi)試劑對(duì)來(lái)自確診結(jié)核病患者的臨床樣本培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)。如從臨床樣本培養(yǎng)物中檢出結(jié)核分枝桿菌基因組中與某種結(jié)核藥物耐藥相關(guān)的基因突變，則提示提供該臨床樣本的結(jié)核病患者可能對(duì)該結(jié)核藥物耐藥，該結(jié)核病患者為對(duì)某種結(jié)核藥物耐藥的耐藥結(jié)核病患者。

與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比，基因藥敏試驗(yàn)敏感性更高，操作更簡(jiǎn)單可行，且能更快獲得結(jié)果。因此，基因藥敏試驗(yàn)一經(jīng)問(wèn)世，即獲得許多臨床使用單位的青睞。目前臨床可用的基因藥敏試驗(yàn)試劑多為一線(xiàn)結(jié)核藥物耐藥檢測(cè)試劑。隨著我國(guó)耐藥結(jié)核病患者的急劇增多，二線(xiàn)結(jié)核藥物耐藥結(jié)核病病例也頻見(jiàn)報(bào)道，臨床急需二線(xiàn)結(jié)核藥物基因藥敏試驗(yàn)檢測(cè)試劑［4-5］。

2 該類(lèi)試劑的注冊(cè)情況

該類(lèi)試劑采用分子生物學(xué)方法定性檢測(cè)臨床樣本培養(yǎng)物中結(jié)核分枝桿菌基因組中與特定耐藥相關(guān)的基因突變，用于耐藥結(jié)核病的輔助診斷，便于臨床醫(yī)生合理選擇結(jié)核藥物。截至目前，經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的國(guó)產(chǎn)基因藥敏試驗(yàn)試劑有9 個(gè)，進(jìn)口基因藥敏試驗(yàn)試劑有3 個(gè)，用于耐藥性檢測(cè)的藥物類(lèi)型主要為結(jié)核患者一線(xiàn)藥物，包括利福平、異煙肼、鏈霉素和佛喹諾酮等。方法學(xué)主要包括線(xiàn)性雜交酶顯色法、熔解曲線(xiàn)法、基因芯片法和一代測(cè)序法等。

3 該類(lèi)試劑設(shè)計(jì)研發(fā)時(shí)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注的技術(shù)問(wèn)題

3.1 質(zhì)控

為避免臨床使用時(shí)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果對(duì)患者的危害，應(yīng)對(duì)該類(lèi)試劑的檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行有效質(zhì)控。因此，該類(lèi)試劑應(yīng)設(shè)立內(nèi)標(biāo)、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，以對(duì)樣本核酸分離純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染和靶核酸降解等進(jìn)行合理質(zhì)控，避免出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。內(nèi)標(biāo)、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均應(yīng)參與樣本核酸的平行提取純化。

3.2 主要原材料研究

對(duì)于該類(lèi)試劑而言，主要原材料主要為引物、探針、反應(yīng)液和聚合酶。該類(lèi)試劑一般可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因突變位點(diǎn)。因此，產(chǎn)品設(shè)計(jì)時(shí)需設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針。如多對(duì)引物和探針存在于一個(gè)反應(yīng)體系，則應(yīng)在設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)時(shí)著重驗(yàn)證不同引物探針對(duì)彼此的干擾。鑒于一般引物探針為外購(gòu)，應(yīng)提交對(duì)引物探針供應(yīng)商的選擇依據(jù)及研究數(shù)據(jù)。對(duì)于自制聚合酶，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立穩(wěn)定的自制聚合酶的工藝流程及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 企業(yè)參考品

企業(yè)參考品對(duì)該類(lèi)試劑的質(zhì)量控制至關(guān)重要。企業(yè)應(yīng)建立科學(xué)合理的陽(yáng)性參考品、陰性參考品、精密性參考品和最低檢出限參考品。陽(yáng)性參考品、最低檢測(cè)限參考品和精密度參考品，應(yīng)包括試劑聲稱(chēng)的全部基因突變類(lèi)型，且各參考品的突變類(lèi)型需經(jīng)過(guò)金標(biāo)準(zhǔn)方法或已上市同類(lèi)分型試劑的確認(rèn)。常見(jiàn)突變類(lèi)型的上述參考品至少有1～2 種突變類(lèi)型采用菌株，其他突變類(lèi)型的上述參考品可以采用含有突變的核酸。陰性參考品可采用經(jīng)確認(rèn)靶序列未發(fā)生突變的結(jié)核分枝桿菌菌株或試劑聲稱(chēng)的其他無(wú)關(guān)突變類(lèi)型的核酸等。

4 分析性能評(píng)估

分析性能評(píng)估資料是注冊(cè)申報(bào)資料的重要技術(shù)文件。該類(lèi)試劑的分析性能評(píng)估資料需要著重考慮最低檢測(cè)限、分析特異性和配套核酸提取試劑的提取效率等。

擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的突變序列百分率和總核酸濃度兩個(gè)因素對(duì)最低檢測(cè)限的影響較大，終體系中突變序列的百分率越高、所含的核酸量越多，則越容易檢出。而終體系中的這兩個(gè)因素是由臨床樣本中的結(jié)核分枝桿菌耐藥菌與野生菌的含量和相對(duì)比例決定的。因此，在進(jìn)行最低檢出限研究時(shí)，應(yīng)考慮100%耐藥比例下，耐藥菌株/突變核酸的最低檢測(cè)濃度；同時(shí)，應(yīng)考慮不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測(cè)限。

還應(yīng)特別考慮申報(bào)產(chǎn)品的分析特異性，關(guān)注野生型序列是否會(huì)檢出突變陽(yáng)性，以及申報(bào)產(chǎn)品聲稱(chēng)的全部突變類(lèi)型間是否存在交叉。另外，還需對(duì)核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。

另外，還需特別注意干擾物質(zhì)對(duì)申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)性能的影響。應(yīng)考慮內(nèi)源性干擾和外源性干擾。內(nèi)源性干擾主要考慮臨床樣本中可能含有的物質(zhì)對(duì)申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)性能的影響，一般采用不含待檢野生/突變靶標(biāo)的相應(yīng)臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)。而外源性干擾則主要考慮外源性藥物帶來(lái)的干擾，包括異煙肼、利福平、抗生素和鼻腔噴霧劑或滴鼻劑等常見(jiàn)藥物的干擾等。

鑒于核酸提取效率對(duì)申報(bào)產(chǎn)品的后續(xù)檢測(cè)具有重要影響，生產(chǎn)企業(yè)還需考慮不同樣本前處理方法和核酸提取純化方法對(duì)申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)性能的影響。如某種樣本類(lèi)型可采用幾種方法進(jìn)行樣本前處理或采用幾種方法進(jìn)行核酸提取純化，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)提交適用的樣本前處理方法或核酸提取純化方法與后續(xù)試驗(yàn)配合進(jìn)行的性能試驗(yàn)，以證明不同的樣本前處理方法或核酸提取純化方法不影響檢測(cè)結(jié)果。

5 結(jié)論與展望

本文總結(jié)了結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測(cè)試劑的臨床應(yīng)用價(jià)值和注冊(cè)情況，并對(duì)該類(lèi)試劑設(shè)計(jì)研發(fā)時(shí)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注的產(chǎn)品設(shè)計(jì)、主要原材料選擇和性能評(píng)估等技術(shù)問(wèn)題進(jìn)行探討，以期對(duì)生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行相關(guān)試劑的注冊(cè)申報(bào)進(jìn)行技術(shù)指導(dǎo)。生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)關(guān)注方法學(xué)本身的特點(diǎn)，不斷優(yōu)化原材料與體系設(shè)置，不斷提高產(chǎn)品性能，確保產(chǎn)品滿(mǎn)足臨床使用需求。