病毒性肝炎血清標(biāo)志物檢測方法新進(jìn)展

李軼春

病毒性肝炎是指由病毒引起的肝臟炎癥，根據(jù)病原學(xué)分類將其分為甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E Virus，HEV）。病毒性肝炎大流行對生命、社區(qū)和衛(wèi)生系統(tǒng)將會造成重大損失。據(jù)估計，全球每年有140 萬人死于急性感染以及與肝炎相關(guān)的肝癌和肝硬化，其中，大約47%是由HBV引起的，48%是由HCV 引起的，其余是由HAV 和HEV 引起的［1］。HBV 感染是導(dǎo)致中國人群發(fā)生肝癌的主要危險因素，目前，仍有930 萬慢性HBV 感染者［2］，與HBV 相關(guān)的肝癌患者約占所有肝癌患者的80%［3-4］。預(yù)計到2030年全球?qū)⒙愿窝赘腥韭蕪哪壳暗?00～1 000 萬例降低到90 萬例，將慢性肝炎年死亡率從140 萬例降低到50 萬例以下［5］。此外，病毒性肝炎也是導(dǎo)致艾滋病毒感染者死亡的一個日益嚴(yán)重的原因，同時感染艾滋病毒及HCV 人數(shù)約達(dá)290 萬，260 萬人感染了HBV［6］。病毒性肝炎是一項(xiàng)國際公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，因此，提高病毒性肝炎的診斷率，找到靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測指標(biāo)，對降低病毒性肝炎的發(fā)病率、癌變率、致殘致死率至關(guān)重要。在這篇綜述中，筆者將總結(jié)目前關(guān)于病毒性肝炎的血清標(biāo)志物及檢測方法，旨在為臨床篩查提供思路，以期早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防，早診斷、早治療。

1 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA 是在免疫酶技術(shù)（immunoenzymatic techniques）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)，具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點(diǎn)。ELISA 過程包括抗原吸附在固相載體上（即包被），加待測抗體，加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體，生成抗原-待測抗體-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。檢測者采用分光光度計的光吸收計算抗體的量，并將待測抗體的定量與有色產(chǎn)生成正比。

2 時間分辨熒光免疫技術(shù)（Time-Resoled Fluoroimmunoassay，TRFIA）

TRFIA 是運(yùn)用三價稀土離子及其螯合劑作為示蹤物代替熒光物質(zhì)、同位素或酶標(biāo)記蛋白質(zhì)、多胎、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，當(dāng)反應(yīng)體系發(fā)生后用TRF 儀器測定最后產(chǎn)物中熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度或相對熒光強(qiáng)度比值來判斷反應(yīng)體系被分析物的濃度達(dá)到定量分析之目的。通過利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖匦?，熒光激發(fā)后在固定時間段檢測特異性熒光，而在此時間之前，非特異性熒光已完全衰減為0，從而提高了檢測的靈敏度，縮短了急性乙肝檢測的“窗口期”。TRFIA 具有零本底、靈敏度高、線性范圍寬、試劑有效期長、標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性好、易于自動化等特點(diǎn)。

3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（Electro-Chemiluminescence Immunoassay，ECLIA）

ECLIA 主要在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，是采用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記Ab 通過Ag-Ab 反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對待測的Ag或Ab 進(jìn)行定量/定性，是繼TRFIA 之后的新一代標(biāo)記免疫測定技術(shù)，是電化學(xué)發(fā)光和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物，具有敏感度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、測定范圍寬、試劑穩(wěn)定、無毒害無污染、有效期長、操作簡單、耗時短、易于自動化等特點(diǎn)。

4 化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法（Chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）

CMIA 分為小分子抗原物質(zhì)的測定采用競爭法和大分子的抗原物質(zhì)測定采用雙抗體夾心法，主要包括兩種反應(yīng)過程：（1）競爭反應(yīng)：用過量包被磁顆粒的抗體，與待測的抗原和定量的標(biāo)記吖啶酯抗原同時加入反應(yīng)杯溫育，其免疫反應(yīng)的結(jié)合形式有兩種，一是標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合成復(fù)合物；二是測定抗原與抗體的結(jié)合形式；（2）雙抗體夾心法：標(biāo)記抗體與被測抗原同時與包被抗體結(jié)合成一種反應(yīng)形式，即包被抗體-測定抗原-發(fā)光抗體的復(fù)合物。

5 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)QPCR）

FQPCR 包括探針類和染料類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指導(dǎo)擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，其具有特異性好、靈敏度高、線性關(guān)系好、線性范圍寬、操作簡單、安全、自動化程度高、防污染、速度快、高通量等特點(diǎn)。染料類主要原理為當(dāng)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，外來的光源激發(fā)供體熒光染料發(fā)出熒光，當(dāng)其發(fā)射波長與受體熒光染料的吸收波長部分重疊，且兩者的距離很近時，受體熒光染料吸收供體熒光傳遞的能量而激發(fā)出另一波長的熒光，同時將供體熒光淬滅。

6 免疫學(xué)方法檢測技術(shù)在臨床中的應(yīng)用

黃旭華等人［7］分別以ELISA、膠體金法行免疫學(xué)檢驗(yàn)HAV，分析檢驗(yàn)結(jié)果，研究結(jié)果顯示，采用ELISA 檢測HAV 的診斷準(zhǔn)確率較高。鄒錦群等人［8］在2017年豐城市300 人5 種傳染病抗體水平監(jiān)測分析研究中采用ELISA 檢測HAV 抗體，結(jié)果顯示HAV Ab 被檢出的陽性率較高，側(cè)面印證了ELISA 用于檢測HAV 的臨床可行性。黃嫵姣等人［9］分別用ECLIA 和ELISA 檢測HAV 抗體IGM，以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，比較并分析了陽性符合率，研究結(jié)果顯示，ECLIA 檢測HAV-IgM 的敏感度為62.5%、特異性為100.0%、陽性檢出率為4.3%，ELISA 檢測的敏感度為100.0%、特異性為71.3%、陽性檢出率為33.6%，通過結(jié)果可以看出，ECLIA 和ELISA 兩種檢測方法對于檢測HAV 的一致性很低，但二者各有優(yōu)勢，ELISA 檢測HAV 的敏感度高，ECLIA 檢測HAV 的特異性強(qiáng)。此外，王峰蕾等人［10］參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會的EP15-A2 文件和中國合格評定國家認(rèn)可委員會的CNALCL39 相關(guān)文獻(xiàn)，對全自動酶聯(lián)免疫分析儀測定HAV-IgM 的精密度、檢出限、正確度以及試劑盒的臨界值進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，陽性結(jié)果符合率為100%，提示全自動酶聯(lián)免疫分析儀檢測方法更標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范，結(jié)果更客觀。以上學(xué)者的研究均證實(shí)了ELISA 檢測法在HAV 篩查中的廣泛應(yīng)用及特異性、敏感性。

焦陽等人［11］探討分別采用ECLIA 和ELISA 兩種不同免疫檢驗(yàn)方法檢測HBV 感染血清學(xué)標(biāo)志物的臨床對比情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ECLIA 檢測HBV較ELISA 檢測的準(zhǔn)確率高，但在陽性檢出率的對比上差別不大。趙超芬［12］對比用ECLIA、ELISA及TRFIA 檢測HBV 標(biāo)志物在診斷HBV 中的應(yīng)用價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用CLIA 法檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg 的陽性檢出率均為最高，使用ELISA法檢測HBeAb 的陽性檢出率最高，使用TRFIA 法檢測HBcAb 的陽性檢出率最高，使用TRFIA 法診斷HBV 的靈敏度和特異度均高于用ELISA 法，可以推測三種檢測方法各有優(yōu)勢，臨床中可根據(jù)患者的個體差異，選擇不同的檢測方法。王紅翠等人［13］探討了化學(xué)發(fā)光法及ELISA 法兩種不同檢測技術(shù)應(yīng)用于乙型肝炎病毒核心抗體陽性率篩查中的臨床價值及檢測意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光法檢測的陽性率更高，結(jié)果更準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)更客觀真實(shí)，具有預(yù)測作用。上述結(jié)果表明ECLIA 和ELISA、CLIA 等檢測方法在臨床篩查HBV 各有優(yōu)勢，應(yīng)根據(jù)臨床實(shí)際選擇單獨(dú)檢測或聯(lián)合檢測。

薛海玲等人［14］比較CMIA 法、ELISA 法在HCV 檢測中的應(yīng)用效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CMIA 法檢測HCV-Ab 陽性率為100%，ELISA 法檢測HCV-Ab陽性率為76.32%，CMIA 法檢測HCV-Ab 的靈敏度高于ELISA 法，CMIA 法與ELISA 法檢測HCV-Ab陽性一致率為72.32%，總一致率為92.21%，得出結(jié)論為CMIA 法測定HCV-Ab 的精密度、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值均較高。吳小文［15］搜集120 例HCV 患者血清標(biāo)本，分別采用ELISA、ECLIA、熒光定量PCR 法進(jìn)行檢測，觀察并分析三種檢驗(yàn)方法的檢驗(yàn)結(jié)果，檢測結(jié)果顯示，采用ELISA 檢測HCV 的陽性率為73.33%，采用ECLIA 檢測HCV的陽性率為75.00%，采用熒光定量PCR 法檢測HCV 的陽性率為90.83%，檢測準(zhǔn)確率均較高，但僅有采用熒光定量PCR 法檢測HCV 具有統(tǒng)計學(xué)意義。上述研究結(jié)果可以推測采用熒光定量PCR法檢測HCV 結(jié)果最佳。

近年來，病毒性肝炎血清標(biāo)志物檢測方法不斷發(fā)展、更新。神經(jīng)生長因子（Neural growth factor，NGF）含有兩種非共價結(jié)合單體，每個單體都有四個帶有極性氨基酸序列的環(huán)區(qū)和兩條β鏈。在肝臟微環(huán)境中，NGF 在受損肝細(xì)胞中表達(dá)，參與對肝損傷的控制過程，主要是通過p75NTR 對纖維化細(xì)胞發(fā)揮凋亡作用，并上調(diào)膽汁淤積性肝組織中的肝保護(hù)成分。Pereira［16］的研究發(fā)現(xiàn)具有與正調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)保守和因子生理學(xué)相關(guān)的多態(tài)性變異的患者表現(xiàn)出與病毒載量和肝酶相反的行為，表明NGF 和p75NTR 在炎癥和纖維化的不同階段相互作用。Sun［17］的研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)蛋白有助于診斷與鑒別HBV 及肝衰竭，評估肝功能異常和預(yù)測肝病結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HNF-1α 和HNF-4α 兩種肝核因子與肝功能相關(guān)，富含組氨酸的糖蛋白（histidine-rich glycoprotein，HRG）可反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱，為臨床制定診斷方案及治療策略提供數(shù)據(jù)。基于超聲的彈性成像和血清指標(biāo)已被單獨(dú)驗(yàn)證為慢性病毒性肝炎肝纖維化分期的無創(chuàng)方法，Udompap［18］以HBV 或HCV 單感染患者為研究對象，旨在比較病毒性肝炎患者瞬時彈性成像（transient elastography，TE）、剪切波彈性成像（shear wave elastography，SWE）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶血小板指數(shù)和纖維化-4 指數(shù)（Fibrosis-4，F(xiàn)IB4）與肝纖維化分期的準(zhǔn)確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用M 或XL 探針的超聲心動圖是一種極好的彈性成像技術(shù)，可無創(chuàng)地預(yù)測HBV 或HCV 患者的肝纖維化程度，特別是晚期纖維化和肝硬化患者。SWE 點(diǎn)可以作為排除晚期纖維化和肝硬化的輔助超聲工具。雖然FIB4的診斷準(zhǔn)確性低于某些彈性成像技術(shù)，但在醫(yī)療技術(shù)有限的情況下，F(xiàn)IB4 在臨床上可用于排除肝硬化。Khodjaeva［19］對6589 例病毒性肝硬化患者進(jìn)行HBV 單次感染、HCV 感染和高密度脂蛋白重疊感染乙型肝炎表面抗原陽性肝硬化的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)超過80%的HBV 表面抗原陽性肝硬化患者存在高密度脂蛋白雙重感染，高密度脂蛋白似乎是晚期病毒性肝病和青少年肝硬化的主要原因。循環(huán)自耗蛋白（Autotaxin，ATX）在肝病患者中升高，特別是在HCV 病毒和丙型肝炎病毒/艾滋病感染的環(huán)境中，血漿ATX 水平部分歸因于纖維化肝病繼發(fā)的肝臟清除受損。Kostadinova［20］發(fā)現(xiàn)血漿ATX 與HCV 和丙型肝炎病毒/艾滋病感染期間的系統(tǒng)免疫激活參數(shù)有關(guān)，在開始無干擾素直接作用抗病毒丙型肝炎病毒治療的幾個月內(nèi)，ATX 水平部分正?；?，這與非纖維化肝病導(dǎo)致ATX 水平升高或丙型肝炎病毒介導(dǎo)的肝細(xì)胞活化一致。ATX、溶血磷脂酸和全身免疫激活參數(shù)之間的關(guān)系與丙型肝炎病毒感染、肝細(xì)胞癌等相關(guān)，認(rèn)為ATX 水平通常與ATX 酶活性產(chǎn)物溶血磷脂酸的水平相關(guān)，是一種通過溶血磷脂酸受體傳遞信號的脂質(zhì)介質(zhì)；ATX-LPA 軸與丙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒/艾滋病感染環(huán)境中的系統(tǒng)性免疫激活相關(guān)；在慢性肝病毒感染期間，非纖維化和可逆成分導(dǎo)致ATX 水平升高。Joanna［21］對138 例慢性丙型病毒性肝炎患者進(jìn)行了戊聚糖3（Pentosan 3，PTX3）與炎癥活性和纖維化的生化和組織學(xué)參數(shù)的相關(guān)性研究，目的是探究PTX3 檢測HCV 患者的臨床顯著纖維化的準(zhǔn)確性，證實(shí)了PTX3 作為顯著纖維化的單一標(biāo)志。

7 小結(jié)與展望

不同的免疫學(xué)檢測技術(shù)適用于不同的病毒性肝炎分型，為了實(shí)現(xiàn)2030年徹底將病毒性肝炎這一疾病徹底根除的終極目標(biāo)，臨床醫(yī)師、科研專家還需更加努力，不斷提高檢測技術(shù)水平，不斷更新檢測設(shè)備及試劑盒，規(guī)范檢測流程。