人腺病毒工程化應(yīng)用研究進(jìn)展

趙陽(yáng)，張其威，夏雪山

·綜 述·

人腺病毒工程化應(yīng)用研究進(jìn)展

趙陽(yáng)1，張其威2，夏雪山1

1 昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 云南省分子診斷工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500 2 南方醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510515

人腺病毒流行廣泛，感染常誘發(fā)呼吸道疾病、流行性結(jié)膜炎等疾病。腺病毒是研究較為深入的一類病原體，并且作為病毒載體已廣泛應(yīng)用，也是基因治療最常用的病毒載體，尤其在腫瘤基因治療和病毒溶瘤方面具有較大的研究?jī)r(jià)值和臨床應(yīng)用潛力。文中對(duì)腺病毒的生物學(xué)特性以及應(yīng)用范圍等方面進(jìn)行綜述，以期為腺病毒的工程化與臨床應(yīng)用提供參考。

人腺病毒，載體，溶瘤，工程化應(yīng)用

1953年，Rowe等首次從呼吸道感染的嬰兒扁桃體腺中分離培養(yǎng)得到一種新的病毒，被鑒定命名為腺病毒[1]。腺病毒可分為A–G七個(gè)種，目前己鑒定出100多個(gè)基因型。人腺病毒 (Human adenovirus，HAdV) 屬于腺病毒科 (Adenoviridae)哺乳動(dòng)物腺病毒屬。腺病毒感染臨床較為常見，感染常發(fā)生的器官系統(tǒng)為眼角膜和呼吸道。腺病毒感染具有自限性，但對(duì)一些特殊人群如免疫力低下人群、兒童等，其感染會(huì)導(dǎo)致較為嚴(yán)重的后果。因?yàn)榫哂型庠椿蜉^大的裝載容量，腺病毒作為基因表達(dá)載體的研究與應(yīng)用始于20世紀(jì)60年代，是研究最深入的病毒載體之一，已廣泛地應(yīng)用于基因治療和病毒溶瘤等方面。被廣泛關(guān)注的溶瘤腺病毒(Oncolytic adenovirus) 經(jīng)過基因改造，充分利用了腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在基因組成、功能代謝等方面的差異，使病毒載體在腫瘤細(xì)胞中特異增殖，進(jìn)而裂解腫瘤細(xì)胞，而僅對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生有限的損傷。盡管具有較好應(yīng)用前景，腺病毒工程化應(yīng)用還具有較多待改進(jìn)之處。

1 腺病毒的生物學(xué)特性

自腺病毒首次分離出來(lái)，已經(jīng)確定的腺病毒共有A–G七個(gè)種，超過100個(gè)血清型[2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展以及對(duì)腺病毒的不斷探索，對(duì)腺病毒的結(jié)構(gòu)及其基因組復(fù)制機(jī)制研究得比較清楚。人腺病毒感染在世界范圍內(nèi)流行廣泛，并誘發(fā)人體多種炎癥疾病。但由于腺病毒感染宿主具有高度的種屬特異性，尚無(wú)法在非自然宿主中有效感染和復(fù)制。

1.1 腺病毒的結(jié)構(gòu)

腺病毒屬線性雙鏈DNA病毒，病毒顆粒直徑65–90 nm，為無(wú)包膜二十面體結(jié)構(gòu)，由240個(gè)六鄰體組成，每個(gè)頂點(diǎn)處有12個(gè)五鄰體蛋白，并有從每個(gè)五鄰體突出的12個(gè)纖維蛋白三聚體。人腺病毒基因組全長(zhǎng)約36 kb，包括早期轉(zhuǎn)錄基因 (E1A、E1B、E2、E3、E4) 和晚期轉(zhuǎn)錄基因 (L1–L5)。E1A是基因組中最早被轉(zhuǎn)錄的基因，其編碼產(chǎn)物與宿主細(xì)胞pRb蛋白結(jié)合，導(dǎo)致E2F轉(zhuǎn)錄因子與pRb蛋白分離，進(jìn)而激活E2F介導(dǎo)其他早期轉(zhuǎn)錄基因 (E1B、E2、E3、E4) 的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)病毒DNA的復(fù)制。隨后，E1B編碼的E1B-55K蛋白與細(xì)胞的p53蛋白結(jié)合并使之失活，同時(shí)E1B-19K蛋白作為細(xì)胞凋亡因子阻止細(xì)胞凋亡。E2則編碼病毒基因組復(fù)制所必需的3種蛋白：前體末端蛋白 (pTP)、聚合酶 (Pol) 和單鏈DNA結(jié)合蛋白 (DNA binding protein，DBP)。E3基因編碼可破壞宿主免疫反應(yīng)的蛋白(10.4K、14.5K、14.7K和19K)，其中19K糖蛋白 (gp19) 下調(diào)MHC Ⅰ介導(dǎo)的抗原呈遞給細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，從而阻止細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)病毒的殺傷作用；在病毒復(fù)制晚期，E3基因編碼的蛋白可促進(jìn)病毒粒子的釋放和加快被感染細(xì)胞的死亡[3]。E4的基因產(chǎn)物主要參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的終止和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)[4-7]。晚期基因的轉(zhuǎn)錄起始于主要晚期啟動(dòng)子(Major late promoter，MLP)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物參與腺病毒基因組的調(diào)控，并編碼成熟病毒顆粒裝配所必需的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白。

1.2 腺病毒復(fù)制機(jī)制

腺病毒能在人體細(xì)胞中高效復(fù)制，被感染宿主細(xì)胞48 h內(nèi)能產(chǎn)生約107拷貝的病毒DNA，較高的復(fù)制效率使其成為基因治療載體的主要選擇。腺病毒感染細(xì)胞主要分為3個(gè)步驟：1) 腺病毒的纖維蛋白與宿主細(xì)胞膜上的腺病毒-柯薩奇受體 (Coxsackievirus-adenovirus receptor，CAR)結(jié)合；2) 病毒與整合素受體結(jié)合，經(jīng)過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，脫去衣殼，病毒DNA通過核孔進(jìn)入宿主細(xì)胞核；3) 基因轉(zhuǎn)錄及病毒DNA復(fù)制[8]。腺病毒的DNA復(fù)制主要需要5種蛋白質(zhì)：包括由病毒自身編碼產(chǎn)生的3種蛋白pTP、Pol和 DBP，以及來(lái)自宿主細(xì)胞的2種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NFI和Oct-1。pTP、Pol和DBP在一起可以啟動(dòng)DNA復(fù)制，但復(fù)制效率低，而且鏈的延伸有限。而細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NFI和Oct-1的加入使得病毒DNA的復(fù)制效率增強(qiáng)約200倍。HAdV的DNA復(fù)制起始發(fā)生于模板鏈的第4個(gè)堿基，形成三核苷酸中間體pTP-CAT，然后pTP-CAT中間體回跳3個(gè)堿基與模板鏈的殘基1–3配對(duì)，在三核苷酸跳躍期間或之后，Pol與pTP解離，延伸繼續(xù)[9-11]。

1.3 腺病毒宿主范圍

人腺病毒感染宿主具有高度的種屬特異性，由于感染受體的差異及宿主范圍限制因子的存在，病毒一般只能在自然宿主中有效感染及復(fù)制，在非自然宿主中病毒的基因表達(dá)和復(fù)制受限，無(wú)法或只能產(chǎn)生少量的子代病毒。研究發(fā)現(xiàn)，非洲綠猴腎細(xì)胞 (AGMK) CV-1P細(xì)胞系對(duì)腺病毒的宿主范圍限制因子為FAM111A，其存在使得GMK不支持人腺病毒的復(fù)制[12]；當(dāng)FAM111A被敲除時(shí)HAdV5可在CV-1P細(xì)胞系中進(jìn)行生產(chǎn)性復(fù)制并能形成細(xì)胞噬斑。因此，宿主范圍限制因子的鑒別及敲除是建立人腺病毒異種動(dòng)物或細(xì)胞模型的前提[13]。另外，細(xì)胞膜蛋白CAR、CD46和DSG2為腺病毒感染的常見受體[14-15]。B型腺病毒的感染受體主要為人的CD46和DSG2，但無(wú)法與小鼠、倉(cāng)鼠等嚙齒類動(dòng)物的CD46及DSG2結(jié)合，導(dǎo)致B種腺病毒無(wú)法感染嚙齒類動(dòng)物[16-17]。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物與人的親緣關(guān)系最為接近，但至今研究仍未證明人腺病毒可在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生復(fù)制，有必要發(fā)現(xiàn)限制性因素并進(jìn)行基因敲除或基因編輯，以建立非人靈長(zhǎng)類人腺病毒動(dòng)物模型。

1.4 腺病毒的流行感染與致病

腺病毒是急性呼吸系統(tǒng)感染的主要病原體，在全世界范圍廣泛流行，并呈現(xiàn)季節(jié)波動(dòng)性小、地方散發(fā)為主的流行病學(xué)特征[18]。免疫功能低下或缺陷人群最易被HAdV感染，可能來(lái)自外源新發(fā)感染，也可能源于潛伏感染病毒的激活[19]。全球范圍內(nèi)人群感染腺病毒類型主要為B種 (HAdV3、HAdV7、HAdV11、HAdV14、HAdV55)和C種 (HAdV1、HAdV2、HAdV5)，中國(guó)境內(nèi)呼吸道感染腺病毒的主要類型為B3和B7基因型，各基因型病毒的不同流行株具有明顯的地域限制性[20]。

腺病毒感染誘發(fā)的疾病包括急性呼吸道疾病和急性支氣管炎[21]、流行性結(jié)膜炎、腸胃炎、角膜結(jié)膜炎、腦膜腦炎、膀胱炎、心肌炎甚至重癥肺炎，并可能導(dǎo)致肥胖等非炎癥癥狀[22-29]。腺病毒傳播的方式主要為空氣飛沫、直接接觸污染物或是受感染的組織、飲用感染的水源，并可通過糞-口途徑傳播[30]。根據(jù)病毒類型及感染方式的不同，腺病毒感染后的潛伏期從2 d到2周不等，盡管腺病毒感染的致病性較弱且具有自限性，但也可能導(dǎo)致嚴(yán)重病癥[31]。如C種腺病毒可在80%的感染兒童的扁桃體淋巴細(xì)胞中建立持續(xù)感染。而B種腺病毒感染更常見于成年人，且感染癥狀更為嚴(yán)重[32-33]。B7亞型腺病毒感染者發(fā)生重癥比例尤其高[21]。

2 腺病毒載體的類型及優(yōu)化

自20世紀(jì)60年代腺病毒就被作為基因表達(dá)載體，在分子生物學(xué)領(lǐng)域得到應(yīng)用。腺病毒載體具有其他載體不具備的諸多特點(diǎn)，多種類型的腺病毒載體得以成功構(gòu)建，并獲得工程化應(yīng)用。

目前，用作腫瘤治療的載體主要有兩大類：病毒載體和非病毒載體。腺病毒是研究最深入的病毒載體之一，也是目前基因治療最常用的病毒載體。與其他病毒載體相比較，腺病毒載體具有病毒載體本身基因突變率低、可同時(shí)插入并表達(dá)多個(gè)基因、外源基因表達(dá)效率高且不影響病毒復(fù)制、可插入更大的外源基因片段、能使外源基因良好的表達(dá)并不影響病毒復(fù)制、病毒顆粒穩(wěn)定不易突變、能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因、重組病毒易于高滴度生產(chǎn)、重組后的腺病毒致病力低或不致病等特點(diǎn)[6,34-35]，因此被廣泛用作基因治療和溶瘤。

腺病毒和腺病毒載體具有一定的免疫原性，在宿主體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生先天或獲得性的免疫反應(yīng)[36]，可能影響腺病毒作為基因治療載體和疫苗開發(fā)的應(yīng)用前景。為消除載體的免疫原性并擴(kuò)大其基因裝載容量，腺病毒載體的研究主要經(jīng)歷了3個(gè)階段，并對(duì)應(yīng)開發(fā)了3種載體類型。最早是將腺病毒載體去掉E1/E3基因區(qū)，可允許約7.5 kb的外源基因插入，此種腺病毒載體會(huì)引起較強(qiáng)的宿主免疫反應(yīng)且插入基因的表達(dá)不穩(wěn)定。進(jìn)而，將腺病毒的E2區(qū)或E4區(qū)基因部分或全部敲除，該載體最大允許約14 kb的外源基因插入，外源基因在宿主細(xì)胞中更加穩(wěn)定表達(dá)，載體引起的宿主抗病毒免疫反應(yīng)大大減弱。最近開發(fā)的腺病毒載體又稱為空殼載體 (Gutless or gutted adenovirus vectors)，僅保留基因組兩端的末端倒置重復(fù)序列 (Inverted terminal repeat，ITR) 及包裝信號(hào)約500 bp的順式作用元件，其他部分功能全部由輔助病毒完成?？諝は俨《驹诒Ａ袅溯^高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，外源基因裝載能力達(dá)到37 kb左右，外源基因的表達(dá)更穩(wěn)定，同時(shí)載體的安全性進(jìn)一步提高。盡管早期的腺病毒載體相比后 兩種載體具有明顯的缺點(diǎn)，但是其基因轉(zhuǎn)移能力適應(yīng)于大多數(shù)的基因治療的需求且更易獲得高滴度病毒，目前仍被廣泛應(yīng)用[6]。

腺病毒也是疫苗開發(fā)中常采用的載體，以 5亞型腺病毒載體居多。然而，5亞型腺病毒因廣泛流行，特別是在發(fā)展中國(guó)家人群中已經(jīng)存在較高抗體水平，可能引起某些特定免疫反應(yīng)，使得基于5亞型腺病毒載體基因工程疫苗的臨床應(yīng)用受到較大限制[37]。同時(shí)，多種血清型的腺病毒載體也被用于HIV-1、埃博拉、流感、結(jié)核、登革、瘧疾等多種傳染病的疫苗開發(fā)，并取得較大的進(jìn)展[38]。雖然腺病毒載體具有很多優(yōu)點(diǎn)，但在臨床應(yīng)用方面依然存在諸多問題，例如攜帶的外源基因持續(xù)時(shí)間較短且缺乏靶向性，尤其是腺病毒載體自身引起的宿主免疫反應(yīng)使得重組病毒易于被機(jī)體清除。因此，有必要提高載體的靶向性，并改造載體提高病毒顆粒的隱蔽性，降低宿主對(duì)載體的免疫識(shí)別[39]?；诖?，有研究將腺病毒顆粒表面的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)體與聚乙二醇 (Polyethylene glycol，PEG) 共價(jià)連接 (PEG化)，PEG化可有效掩蓋病毒蛋白，使載體免受細(xì)胞和體液免疫識(shí)別，從而降低腺病毒載體的免疫原性[40-41]。也可使用精氨酸連接形成生物降解型陽(yáng)離子聚合物 (Arginine-grafted bio-reducible polymer，ABP)，結(jié)合在腺病毒表面的ABP聚合物可降低腺病毒蛋白與血清蛋白結(jié)合，保護(hù)病毒不被免疫識(shí)別并清除，提高基因治療載體的體內(nèi)穩(wěn)定性，并提高了外源插入基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[39]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，腺病毒載體的功能及應(yīng)用方面取得了較大進(jìn)展。但腺病毒載體從實(shí)驗(yàn)室向成熟的臨床應(yīng)用，還需要在其免疫原性及使用安全性等方面展開更為深入的研究。

3 溶瘤腺病毒與腫瘤治療

在目前的腫瘤治療中，傳統(tǒng)療法分為手術(shù)治療、化療和放療等。這些傳統(tǒng)的治療方法并不能完全地殺死腫瘤細(xì)胞并抑制腫瘤細(xì)胞的活性，治療后存活的腫瘤細(xì)胞可能發(fā)生組織間的轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。相較于傳統(tǒng)療法，溶瘤病毒 (Oncolytic viruses，OVs) 還能間接地借助宿主的免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤細(xì)胞，從而在一定程度上大大延長(zhǎng)患者的生命。

溶瘤病毒具有在惡性腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制的能力，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)和癌細(xì)胞裂解，促進(jìn)宿主對(duì)癌細(xì)胞的清除，是一種非常有潛力的腫瘤治療生物藥物[42]。理想的溶瘤病毒應(yīng)該容易生產(chǎn)、易于操作、對(duì)癌細(xì)胞溶解的選擇性強(qiáng)、并具有較強(qiáng)的遞送能力，并且致病性較低。目前，主要有單純皰疹病毒 (T-VEC)、牛痘病毒 (Pexa-vec)、反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒 (ONCOS-102)，可用于溶瘤病毒開發(fā)。單純皰疹病毒和牛痘病毒具有編碼數(shù)百種蛋白質(zhì)的較大基因組，為提高其安全性和特異性，需要敲除較多的基因，而逆轉(zhuǎn)錄病毒則具有其基因組插入到宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)[5]。腺病毒具有廣泛的組織嗜性和感染多種分裂期及非分裂期細(xì)胞的能力，是被研究最為深入的病毒載體之一，在基因治療和病毒溶瘤方面一直具有很高的研究潛力。

用作溶瘤的腺病毒又稱條件復(fù)制型腺病毒 (Conditionally replicating adenoviruses，CRADs)，載體經(jīng)過基因改造，以腺病毒科C2和C5基因亞型哺乳動(dòng)物腺病毒為主。溶瘤腺病毒利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在基因表達(dá)與代謝途徑方面的差異，可在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖，進(jìn)而裂解腫瘤細(xì)胞，但對(duì)正常細(xì)胞僅產(chǎn)生有限傷害[43]。腺病毒突變型ONYX-015是第一種在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制的溶瘤病毒，病毒載體的E1B-55K (P53滅活劑) 片段缺失，使其獲得在腫瘤細(xì)胞特異性增殖的能力，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)甚至溶解細(xì)胞[34]。H101 (E1B-55K與E3缺失) 與ONYX-015功能相似，是第一個(gè)在中國(guó)被批準(zhǔn)開展臨床試驗(yàn)的溶瘤腺病毒[44]。Delta-24溶瘤病毒則是載體E1A基因缺失了Rb蛋白結(jié)合位點(diǎn)，Rb蛋白與E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使得E2F轉(zhuǎn)錄因子不能進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用，因此該溶瘤病毒只能在具有激活的E2F依賴性基因表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制[8, 34]。Delta-24的衍生溶瘤腺病毒DNX-2401也處于研究開發(fā)中。溶瘤腺病毒通過直接溶瘤作用選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，還能引起宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)[45]。

腺病毒載體是一種高效的免疫治療劑，可以成功地用于免疫增強(qiáng)療法。在單一溶瘤作用治療效果不佳的情況下，可將腺病毒載體與現(xiàn)有的免疫治療、基因療法、化學(xué)療法以及放射療法等多種癌細(xì)胞治療方法相結(jié)合，可能更好地清除惡性腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，人體免疫系統(tǒng)具有高效性和全身性的特點(diǎn)，將病毒溶瘤療法和免疫療法相結(jié)合具有更大的臨床應(yīng)用潛力[45-46]。與傳統(tǒng)的放射療法、化學(xué)療法及靶向治療不同，免疫療法是通過刺激宿主自身的免疫系統(tǒng)，引起機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答。某些細(xì)胞因子如IL-2、IL-6、IL-24、GM-CSF、TNF-α[47]等也具有一定的抗腫瘤治療效果，將這些細(xì)胞因子基因插入到病毒載體基因組中，細(xì)胞因子表達(dá)可以增強(qiáng)宿主的免疫反應(yīng)。

溶瘤腺病毒可以攜帶更多的腫瘤治療基因，與傳統(tǒng)治療方法相比具備更多的抗腫瘤活性，但仍然達(dá)不到理想的治療效果。雖然溶瘤腺病毒與傳統(tǒng)治療方法相結(jié)合可以產(chǎn)生更好的治療效果，但提高溶瘤腺病毒的靶向性和安全性依然是未來(lái)的研究方向之一?？偟膩?lái)說(shuō)，隨著各種問題的不斷解決，溶瘤腺病毒將在腫瘤治療中發(fā)揮出不可或缺的作用。

4 腺病毒載體用于基因治療

基因治療是以改變?nèi)说倪z傳基因?yàn)榛A(chǔ)的醫(yī)學(xué)手段，是將有確定功能的基因轉(zhuǎn)移到病人的細(xì)胞中以糾正致病基因的治療方法，是將目的基因?qū)氚屑?xì)胞與宿主的基因相整合并成為宿主遺傳物質(zhì)的一部分。

選擇合適的載體是基因治療最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腺病毒是基因治療最為廣泛采用的載體類別。溶瘤腺病毒自身對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用有限的情況下，在腺病毒基因組上插入腫瘤治療基因，可利用腺病毒載體的復(fù)制并表達(dá)產(chǎn)生抗體蛋白質(zhì)，大大提高治療腫瘤的有效性。早在1980年，腺病毒就被用作基因治療載體，此種缺失E1A基因的腺病毒載體自身不能復(fù)制，可通過攜帶腫瘤抑制因子或自殺基因用于癌癥的基因治療?；蛑委熯€可激活機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)揮作用，如可激發(fā)細(xì)胞因子GM-CSF、IL-2[48]、IL-12[49]、IL-18[50]和IL-24[51]分泌，產(chǎn)生提高T細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性、誘導(dǎo)干擾素-γ (IFN-γ) 的產(chǎn)生、抑制腫瘤血管生成[52]等相關(guān)效應(yīng)，發(fā)揮更大的腫瘤治療效果。

病毒載體插入自殺基因?qū)е履[瘤細(xì)胞死亡，是另一種常用的靶向腫瘤治療方法，將多個(gè)自殺基因和條件復(fù)制啟動(dòng)子結(jié)合應(yīng)用則更大提高選擇性，降低毒副作用。常用的自殺基因包括果蠅多底物脫氧核苷激酶 (Dm-DNK)、胸腺激酶 (TK)、胞嘧啶脫氨酶 (CD) 及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體 (Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)。其中，TRAIL與腫瘤細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，通過死亡結(jié)構(gòu)域激發(fā)和傳導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)、激活caspase蛋白酶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，已經(jīng)被廣泛證實(shí)具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能[53]。

腺病毒載體作為基因治療應(yīng)用最為廣泛的載體之一，雖然在應(yīng)用上仍有一些潛在的問題尚未解決，但腺病毒載體具有其他載體無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，將成為基因治療強(qiáng)有力的工具。

5 討論與展望

隨著對(duì)腺病毒分子結(jié)構(gòu)及感染機(jī)制研究的逐漸深入，腺病毒載體、溶瘤腺病毒以及腺病毒基因治療等方面的開發(fā)應(yīng)用受到更為廣泛關(guān)注，也奠定了良好的研究基礎(chǔ)。已有研究表明，由于常見的呼吸道及多種途徑的腺病毒感染，人體對(duì)腺病毒感染有一定預(yù)先存在的免疫力。若是治療人體較大器官組織系統(tǒng)或?qū)嶓w瘤以及擴(kuò)散性的腫瘤細(xì)胞則必然通過血液進(jìn)行輸送，然而機(jī)體復(fù)雜的免疫機(jī)制可阻止病原體侵入人體并施加各種障礙，甚至引發(fā)急性毒性，嚴(yán)重阻礙了基于腺病毒載體的治療，因此全身遞送基于腺病毒載體的治療方案不可行。腺病毒載體的免疫原性在一定范圍內(nèi)是有利的，能激發(fā)人體本身的免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤細(xì)胞使人體組織細(xì)胞具備更多的抗腫瘤活性，但強(qiáng)大的免疫原性會(huì)阻礙基于腺病毒載體疫苗的治療。另外腺病毒載體的基因治療可在健康的組織中引起免疫反應(yīng)，但由腺病毒載體引起的機(jī)體先天及適應(yīng)性免疫對(duì)已經(jīng)腫大和擴(kuò)散腫瘤的治療效果并不理想。在腺病毒載體上添加多種治療基因，或者在確?；颊甙踩那疤嵯峦ㄟ^對(duì)載體進(jìn)行修飾使其增強(qiáng)溶瘤活性以刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的先天及適應(yīng)性免疫，都是今后基于腺病毒載體的研究方向。另外尚需要深入探索如何使腺病毒載體攜帶外源基因持續(xù)表達(dá)、如何增加病毒顆粒的逃避免疫監(jiān)控的能力、如何提高載體的器官組織靶向定位，以期能構(gòu)建出滿足臨床需要的腺病毒載體。針對(duì)以上腺病毒載體的應(yīng)用需要克服的障礙，解決問題的潛在方法之一是選用其他類型的腺病毒。目前研究的腺病毒載體主要以C種腺病毒為主，盡管已經(jīng)鑒定出了多種腺病毒類型，但對(duì)其他類型的腺病毒仍然缺乏系統(tǒng)的深入性探索，因此其他類型的腺病毒可能在未來(lái)的載體應(yīng)用中發(fā)揮巨大的作用。經(jīng)過基因改造后的溶瘤腺病毒具有更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷能力，其與其他腫瘤治療方法結(jié)合具有更好的治療效果，但溶瘤腺病毒用于治療腫瘤的有效性和安全性需要進(jìn)一步研究。另外，目前仍無(wú)腺病毒疫苗和特效抗腺病毒藥物可用，主要原因是沒有合適的動(dòng)物模型支持腺病毒感染和致病機(jī)制的研究，構(gòu)建人腺病毒感染與致病的動(dòng)物模型也至關(guān)重要。

[1] Rowe WP, Huebner RJ, Gilmore LK, et al. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proc Soc Exp Biol Med, 1953, 84(3): 570–573.

[2] Kosulin K. Intestinal HAdV infection: tissue specificity, persistence, and implications for antiviral therapy. Viruses, 2019, 11(9): 804.

[3] Said A, Woldemariam TA, Tikoo SK. Porcine adenovirus type 3 E3 encodes a structural protein essential for capsid stability and production of infectious progeny virions. J Virol, 2018, 92(20): e00680–18.

[4] Halbert DN, Cutt JR, Shenk T. Adenovirus early region 4 encodes functions required for efficient DNA replication, late gene expression, and host cell shutoff. J Virol, 1985, 56(1): 250–257.

[5] Larson C, Oronsky B, Scicinski J, et al. Going viral: a review of replication-selective oncolytic adenoviruses. Oncotarget, 2015, 6(24): 19976–19989.

[6] Sun P, Lu ZJ, Liu ZX. Advance in adenovirus vector and its application in research on foot-and-mouth disease vaccine. Progr Vet Med, 2007, 28(8): 59–64 (in Chinese). 孫普, 盧曾軍, 劉在新. 腺病毒載體及其在口蹄疫疫苗研究中的應(yīng)用. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2007, 28(8): 59–64.

[7] Liu X, Zhang DL, Liu WH. Progress of target therapy with oncolytic adenovirus for cancer. Progr Mod Biomed, 2011, 11(7): 1382–1384 (in Chinese). 劉旭, 張東亮, 劉文虎. 溶瘤腺病毒在腫瘤靶向治療中的研究進(jìn)展. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011, 11(7): 1382–1384.

[8] Sun T, He XL. Research progress of preparation strategy of oncolytic adenovirus for targeted cancer. Chin J Cancer Biother, 2018, 25(2): 198–205 (in Chinese). 孫婷, 何向蕾. 靶向腫瘤的溶瘤腺病毒制備策略的研究進(jìn)展. 中國(guó)腫瘤生物治療雜志, 2018, 25(2): 198–205.

[9] de Jong RN, van der Vliet PC. Mechanism of DNA replication in eukaryotic cells: cellular host factors stimulating adenovirus DNA replication. Gene, 1999, 236(1): 1–12.

[10] van Breukelen B, Brenkman AB, Holthuizen PE, et al. Adenovirus type 5 DNA binding protein stimulates binding of DNA polymerase to the replication origin. J Virol, 2003, 77(2): 915–922.

[11] Hoeben RC, Uil TG. Adenovirus DNA replication. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2013, 5(3): a013003.

[12] Henry CJ, Slifkin M, Merkow L. Mechanism of host cell restriction in African green monkey kidney cells abortively infected with human adenovirus type 2. Nat New Biol, 1971, 233(36): 39–41.

[13] Fine DA, Rozenblatt-Rosen O, Padi M, et al. Identification of FAM111A as an SV40 host range restriction and adenovirus helper factor. PLoS Pathog, 2012, 8(10): e1002949.

[14] Roelvink P, Lizonova A, Lee JGM, et al. The coxsackievirus-adenovirus receptor protein can function as a cellular attachment protein for adenovirus serotypes from subgroups A, C, D, E, and F. J Virol, 1998, 72(10): 7909–7915.

[15] Annasara L, Liaci AM, Liu Y, et al. Human adenovirus 52 uses sialic acid-containing glycoproteins and the coxsackie and adenovirus receptor for binding to target cells. PloS Pathog, 2015, 11(2): e1004657.

[16] Wang HJ, Beyer I, Persson J, et al. A new human DSG2-transgenic mouse model for studying the tropism and pathology of human adenoviruses. J Virol, 2012, 86(11): 6286–6302.

[17] Trinh HV, Lesage G, Chennamparampil V, et al. Avidity binding of human adenovirus serotypes 3 and 7 to the membrane cofactor CD46 triggers infection. J Virol, 2012, 86(3): 1623–1637.

[18] Sa?l?k I, Mutlu D, Ongüt G, et al. Investigation of adenoviruses in children with lower respiratory tract infections. Mikrobiyol Bul, 2013, 47(2): 282–294.

[19] Radke JR, Cook JL. Human adenovirus infections: update and consideration of mechanisms of viral persistence. Curr Opin Infect Dis, 2018, 31(3): 251–256.

[20] Wang HP, Zheng YJ, Zhao HX, et al. Adenovirus detection in 25 602 hospitalized children with respiratory tract infection. Chongqing Med J, 2018, 47(12): 1661–1663 (in Chinese).王和平, 鄭躍杰, 趙海霞, 等. 25 602例住院兒童呼吸道腺病毒感染檢出分析. 重慶醫(yī)生, 2018, 47(12): 1661–1663.

[21] Chehadeh W, Al-Adwani A, John SE, et al. Adenovirus types associated with severe respiratory diseases: A retrospective 4-year study in Kuwait. J Med Virol, 2018, 90(6): 1033–1039.

[22] Shauer A, Gotsman I, Keren A, et al. Acute viral myocarditis: current concepts in diagnosis and treatment. Isr Med Assoc J, 2013, 15(3): 180–185.

[23] De Ory F, Avellón A, Echevarría JE, et al. Viral infections of the central nervous system in Spain: a prospective study. J Med Virol, 2013, 85(3): 554–562.

[24] Chhabra P, Payne DC, Szilagyi PG, et al. Etiology of viral gastroenteritis in children <5 years of age in the United States, 2008–2009. J Infect Dis, 2013, 208(5): 790–800.

[25] Quintana EC. Adenoviral infections in children: the impact of rapid diagnosis. Ann Emerg Med, 2004, 44(4): 433–434.

[26] Mameli C, Zuccotti GV. The impact of viral infections in children with community-acquired pneumonia. Curr Infect Dis Rep, 2013, 15(3): 197–202.

[27] Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Adenovirus-associated epidemic keratoconjunctivitis outbreaks-four states, 2008–2010. Mmwr Morb Mortal Wkly Rep, 2013, 62(32): 637–641.

[28] Lynch JP, Fishbein M, Echavarria M. Adenovirus. Semin Respir Crit Care Med, 2011, 32(4): 494–511.

[29] Esposito S, Preti V, Consolo S, et al. Adenovirus 36 infection and obesity. J Clin Virol, 2012, 55(2): 95–100.

[30] Matthes-Martin S, Boztug H, Lion T. Diagnosis and treatment of adenovirus infection in immunocompromised patients. Expert Rev Anti Infect Ther, 2013, 11(10): 1017–1028.

[31] Lion T. Adenovirus infections in immunocompetent and immunocompromised patients. Clin Microbiol Rev, 2014, 27(3): 441–462.

[32] Metzgar D, Osuna M, Kajon AE, et al. Abrupt emergence of diverse species B adenoviruses at US military recruit training centers. J Infect Dis, 2007, 196(10): 1465–1473.

[33] Scott MK, Chommanard C, Lu XY, et al. Human adenovirus associated with severe respiratory infection, Oregon, USA, 2013–2014. Emerg Infect Dis, 2016, 22(6): 1044–1051.

[34] Niemann J, Kühnel F. Oncolytic viruses: adenoviruses. Virus Genes, 2017, 53(5): 700–706.

[35] Liu Y, Du LF. Research progress of adenovirus vector. Med Recapitulate, 2015, 21(24): 4438–4440 (in Chinese).劉陽(yáng), 杜聯(lián)芳. 腺病毒載體的研究進(jìn)展. 醫(yī)學(xué)綜述, 2015, 21(24): 4438–4440.

[36] Carlin CR. New insights to adenovirus-directed innate immunity in respiratory epithelial cells. Microorganisms, 2019, 7(8): 216.

[37] Baden LR, Walsh SR, Seaman MS, et al. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 26 HIV-1 Env Vaccine (IPCAVD 001). J Infect Dis, 2012, 207(2): 240–247.

[38] Zhang C, Zhou DM. Adenoviral vector-based strategies against infectious disease and cancer. Hum Vaccin Immunother, 2016, 12(8): 2064–2074.

[39] Uusi-Kerttula H, Hulin-Curtis S, Davies J, et al. Oncolytic adenovirus: strategies and insights for vector design and immuno-oncolytic applications. Viruses, 2015, 7(11): 6009–6042.

[40] Gao JQ, Eto Y, Yoshioka Y, et al. Effective tumor targeted gene transfer using PEGylated adenovirus vector via systemic administration. J Control Release, 2007, 122(1): 102–110.

[41] Reetz J, Herchenr?der O, Pützer BM. Peptide-based technologies to alter adenoviral vector tropism: ways and means for systemic treatment of cancer. Viruses, 2014, 6(4): 1540–1563.

[42] Lichty BD, Breitbach CJ, Stojdl DF, et al. Going viral with cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer, 2014, 14(8): 559–567.

[43] Shaw AR, Suzuki M. Recent advances in oncolytic adenovirus therapies for cancer. Curr Opin Virol, 2016, 21: 9–15.

[44] Liu TC, Kirn D. Gene therapy progress and prospects cancer: oncolytic viruses. Gene Ther, 2008, 15(12): 877–884.

[45] Guo W, Jin J, Xiao BD, et al. Foregrounds and prospects of anti-tumor immunotherapy based on oncolytic adenovirus. Chin J Cell Biol, 2018, 40(6): 1016–1022 (in Chinese). 郭婉, 金槿, 肖伯端, 等. 基于溶瘤腺病毒抗腫瘤免疫治療的前景與展望. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 40(6): 1016–1022.

[46] Zhou XL, Tang WR. Advances in research on oncolytic adenoviruses in tumor therapy. Chin J Virol, 2014, 30(3): 318–324 (in Chinese). 周小龍, 唐文如. 溶瘤腺病毒治療腫瘤的研究進(jìn)展. 病毒學(xué)報(bào), 2014, 30(3): 318–324.

[47] LaRocca CJ, Han J, Gavrikova T, et al. Oncolytic adenovirus expressing interferon alpha in a syngeneic Syrian hamster model for the treatment of pancreatic cancer. Surgery, 2015, 157(5): 888–898.

[48] Gaffen SL, Liu KD. Overview of interleukin-2 function, production and clinical applications. Cytokine, 2004, 28(3): 109–123.

[49] Trinchieri G, Pflanz S, Kastelein RA. The IL-12 family of heterodimeric cytokines: new players in the regulation of T cell responses. Immunity, 2003, 19(5): 641–644.

[50] Hashimoto W, Osaki T, Okamura H, et al. Differential antitumor effects of administration of recombinant IL-18 or recombinant IL-12 are mediated primarily by Fas-Fas ligand- and perforin-induced tumor apoptosis, respectively. J Immunol, 1999, 163(2): 583–589.

[51] Fisher PB, Sarkar D, Lebedeva IV, et al. Melanoma differentiation associated gene-7/interleukin-24 (/IL-24): novel gene therapeutic for metastatic melanoma. Toxicol Appl Pharmacol, 2007, 224(3): 300–307.

[52] Sarkar D, Lebedeva IV, Gupta P, et al. Melanoma differentiation associated gene-7 ()/IL-24: a ?magic bullet’ for cancer therapy? Expert Opin Biol Ther, 2007, 7(5): 577–586.

[53] Zhang Y. LiCl can enhance TRAIL anticancer effect in oncolytic adenovirus vector or[D]. Hangzhou: Zhejiang Sci-Tech University, 2013 (in Chinese). 張媛. LiCl能在溶瘤腺病毒載體中或體內(nèi)增強(qiáng)TRAIL的抗癌作用[D]. 杭州: 浙江理工大學(xué), 2013.

Progress in engineering application of human adenovirus

Yang Zhao1, Qiwei Zhang2, and Xueshan Xia1

1,,,650500,,2,,510515,,

Human adenoviruses are widespread causative agent that induces respiratory diseases, epidemic keratoconjunctivitis and other related diseases. Adenoviruses are commonly used in experimental and clinical areas. It is one of the most commonly used virus vectors in gene therapy, and it has attracted a lot of attention and has a high research potential in tumor gene therapy and virus oncolytic. Here, we summarize the biological characteristics, epidemiology and current application of adenovirus, in order to provide reference for engineering application of adenovirus.

human adenovirus, vector, oncolytic, engineering application

10.13345/j.cjb.190496

November 3, 2019;

February 4, 2020

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. U1702282).

Xueshan Xia. Tel: +86-871-65920756; Fax: +86-871-65920562; E-mail: oliverxia2000@aliyun.com

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. U1702282)資助。

2020-04-09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20200409.1048.001.html

趙陽(yáng), 張其威, 夏雪山. 人腺病毒工程化應(yīng)用研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(7): 1269–1276.

Zhao Y, Zhang QW, Xia XS. Progress in engineering application of Human Adenovirus. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1269–1276.

(本文責(zé)編 郝麗芳)