干細胞外泌體在再生醫(yī)學中的研究與應用

葉青松 ， 胡鳳婷， 羅麗花， Maria Troulis

1.澳大利亞昆士蘭大學牙學院，澳大利亞 布里斯班（4006）； 2.溫州醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院干細胞與組織工程研究所，浙江 溫州（325035）； 3.哈佛大學麻省總醫(yī)院，哈佛大學牙學院口腔頜面外科，美國 波士頓（02114）

外泌體是一類包載有生物活性分子如脂類、核酸、蛋白質(zhì)等的膜性囊泡，直徑大小約為30～100 nm，是已知的最小的胞外囊泡［1］。外泌體可由絕大多數(shù)類型的細胞分泌產(chǎn)生，如腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞等；亦可存在于血液、腦脊液及乳汁等體液中［2］。外泌體的功能主要有賴于其來源細胞的類型，可參與細胞通訊、免疫應答、抗原呈遞、RNA 及蛋白質(zhì)轉運［3］以及腫瘤侵襲［4-5］等多方面的調(diào)控作用。干細胞因來源豐富、取材簡便安全、低免疫原性等優(yōu)點已被作為種子細胞在組織工程和再生醫(yī)學領域得到廣泛關注，且其與外泌體相關的作用機制已成為當前研究的重點和熱點。目前，大量研究證明，干細胞主要經(jīng)旁分泌作用，尤其是外泌體來介導干細胞的生物學功能并誘導其向多種類型細胞進行分化［6-7］。干細胞來源的外泌體具有與干細胞相近的功能，如促進組織修復和再生等；同時，利用外泌體治療又可以規(guī)避干細胞移植的風險，如免疫排斥反應、干細胞再生能力降低、致瘤性等［8-9］。因此，干細胞外泌體有可能成為干細胞療法在組織修復及再生醫(yī)學研究領域中有前景的一種替代療法。

1 外泌體的組成及生理作用

蛋白質(zhì)在外泌體內(nèi)容物中的占比較大且種類多樣，主要分為兩大類，一類是普遍存在于外泌體表面或內(nèi)腔中并參與其結構構成的蛋白質(zhì)，包括骨架蛋白、膜轉運和融合相關蛋白、熱休克蛋白、四跨膜蛋白超家族成員以及多泡小體形成相關蛋白等；另一類是具有一定的特異性，并與其細胞來源有關的蛋白，如富含主要組織相容性復合體-Ⅰ、CD80 相關蛋白的血小板來源外泌體；富含轉化生長因子-β、凋亡相關因子配體相關蛋白的腫瘤細胞來源外泌體等［10］。

外泌體具有脂雙層結構，含有豐富的膽固醇、鞘磷脂、磷脂等，并含有一些功能性的脂類酶。同時，外泌體所含的脂質(zhì)種類因其來自不同的細胞而會有一定的區(qū)別［17］、這些脂質(zhì)分子不但可以保持外泌體正常的外形結構，而且可以參與多種生物學活性過程，如激發(fā)鈣內(nèi)流、調(diào)節(jié)外泌體分泌等［18］。

2 外泌體的形成與釋放

多種類型的細胞均可產(chǎn)生并分泌外泌體，同時外泌體也廣泛存在于體液中，如血液、母乳、腹水等；并存在于大多數(shù)細胞的培養(yǎng)基中［19］。早期外泌體通過非網(wǎng)格蛋白或網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用而形成，其形成釋放過程是母細胞在刺激作用下如DNA 損傷、缺氧等［20］，將顆粒狀物質(zhì)包裹到質(zhì)膜后內(nèi)陷形成多泡小體（multivesicular bodies，MVBs），然后多泡小體與母細胞質(zhì)膜上的特定部位融合形成芽泡，最后母細胞將形成的芽泡以外泌的形式釋放到細胞外［21］。迄今為止，外泌體的形成與釋放機制尚未完全了解，已知的內(nèi)體分選復合體（endosomal sorting complexes required for transport，ESCRTs）在外泌體的形成、分選和分泌過程中擔任著一個關鍵角色，是一種多蛋白復合物，可分為ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ。另外，相關研究表明，ESCRT-非依賴性途徑也參與了外泌體的分泌［22］，在ESCRTs 四個亞單位同時沉默的情況下，MVBs 仍可以產(chǎn)生。

外泌體以出芽方式釋放到胞外后，可以通過旁分泌和內(nèi)分泌兩種方式作用于受體細胞［23］，并通過交換遺傳信息和（或）調(diào)控某些基因表達，參與調(diào)節(jié)受體細胞的各種生物學過程［24］，最終達到改變靶細胞的表型和（或）遺傳型的效果。同時，靶細胞內(nèi)化外泌體的途徑各式各樣［25-26］，如胞吞作用、配體-受體作用以及與目標細胞細胞膜直接融合等。

3 外泌體的富集與鑒定

目前，從細胞培養(yǎng)基或體液中富集外泌體的方法有多種，如超速離心法、密度梯度離心法、免疫磁珠法、試劑盒提取法等。超速離心法作為外泌體提取的金標準，其操作簡便、產(chǎn)量高、不易被污染，但提取到的外泌體常含有凋亡小體等雜質(zhì)，存在純度不高等缺點；經(jīng)密度梯度離心法獲取得到的外泌體綜合產(chǎn)量好且較純，但操作流程異常繁瑣、費時費力；采用免疫磁珠法提取的外泌體特異性高，但對產(chǎn)品的要求嚴格、產(chǎn)量不高；試劑盒法則操作簡便、產(chǎn)量高且工作效率高。隨著對外泌體的研究越來越多，一些新的收集方法也相繼被研發(fā)出來，包括納米橫向位移陣列［27］，納米定側位移（nano-deterministic lateral displacement，nano-DLD）［28］和聚乙二醇法［29］等。其中，nano-DLD 技術可以根據(jù)外泌體的大小對其進行分析、分類和收集，該方法具有良好的生物學功能，便于單顆粒外泌體的分析，不需要特殊標記，樣本量小，且無破壞性［29］。聚乙二醇法是由一種病毒分離法演變而來，先采用低速離心法富集外泌體，再以超速離心法進行進一步的純化。Rider 等［29］采用該方法提取了外泌體并進行檢測，發(fā)現(xiàn)總蛋白和核糖核酸在量和質(zhì)上足以滿足蛋白質(zhì)組學和測序分析的要求，證明了這種分離方法在生物標記物和診斷中的應用；同時，該方法對外泌體的生物學活性沒有負性作用。

外泌體的鑒定主要根據(jù)形態(tài)、體積大小以及表面標記蛋白來進行檢測，電子顯微鏡檢測、納米粒子示蹤分析［30］、流式細胞術［31］、蛋白質(zhì)印跡法［32］和酶聯(lián)免疫吸附試驗等都是常用的檢測手段。電子顯微鏡是最常用的鑒定方法，通過掃描電子顯微鏡以及透射電子顯微鏡可直觀地認識外泌體的表面及內(nèi)部結構；此外，外泌體攜帶的蛋白質(zhì)均可通過流式細胞術、蛋白質(zhì)印跡法和酶聯(lián)免疫吸附試驗等進行檢測。

4 外泌體的優(yōu)點

4.1 外泌體來源豐富、收集簡便

外泌體來源豐富且產(chǎn)量高，多種類型的細胞均可產(chǎn)生并分泌外泌體，且每個細胞平均能產(chǎn)生1 000～10 000 個外泌體。通過超速離心法等方法可從各種體液或培養(yǎng)基中提取外泌體；同時，也可以通過特制的細胞株進行大規(guī)模的生產(chǎn)外泌體。相比干細胞而言，外泌體的獲取方法極為簡便，大大節(jié)省了提取和擴增干細胞的成本和時間。

4.2 外泌體穩(wěn)定性高、可長期存儲

外泌體體積約是干細胞的百萬分之一，復雜性更低，且其結構穩(wěn)定，不易被分解，易于生產(chǎn)和存儲。當前研究［30］發(fā)現(xiàn)-20 ℃保存1 周以內(nèi)對外泌體并無影響，而-80 ℃條件下外泌體則可長期儲存，且外泌體的活性可長期維持。

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4.3 外泌體具有更好的安全性、可規(guī)避干細胞治療風險

目前，基于干細胞的治療方法存在移植后的干細胞生存率和再生能力下降、出現(xiàn)免疫排斥反應等問題。以外泌體作為治療因子的“無細胞”療法則可以避免上述可能出現(xiàn)的問題，由于外泌體膜結合蛋白含量較低，即使是在同種異體給藥后出現(xiàn)免疫排斥的可能性也非常低［2］。另外，外泌體不具備增殖分裂能力，所以不存在形成腫瘤的可能性。因此，外泌體在臨床應用過程中比干細胞具有更好的安全性。

4.4 外泌體是一種理想的載體

外泌體可將自身攜載的活性物質(zhì)轉移到受體細胞內(nèi)進行細胞-細胞間信息交換，因此，外泌體可以作為某些藥物、生物大分子等的有效載體應用于臨床前期或臨床研究。Vader 等［33］研究表明，外泌體因其極小的體積甚至可以進入到深層的組織內(nèi)部，不僅可以防止生物分子被降解從而保持良好的活性，還可以促進生物分子被內(nèi)化進入到受體細胞內(nèi)。Sun 等［34］于2010 年首次運用外泌體作為運載工具攜載并運輸姜黃素，發(fā)現(xiàn)外泌體包裹的姜黃素結構穩(wěn)定，溶解能力提高，血藥濃度更集中，且抗炎作用也在一定程度上也有所增強；動物實驗也證明了外泌體包裹的姜黃素可以保護小鼠免受脂多糖所致的感染性休克。此外，與其他非宿主運載工具不同，外泌體作為一種潛在的載體更具有優(yōu)勢，因其低免疫原性決定了其不會引起免疫排斥反應以及其他并發(fā)癥。

4.5 外泌體應用范圍廣泛

當前，干細胞外泌體在軟骨再生、骨再生、皮膚再生、血管再生、味蕾再生、神經(jīng)組織再生、牙再生、骨骼肌再生、心肌再生、肝臟組織再生、腎臟組織再生、肺組織再生等方面已有了大量的基礎實驗，證明了干細胞外泌體在組織再生方面有著巨大的潛能，為最終實現(xiàn)臨床應用邁進了一大步。

5 干細胞外泌體的臨床前研究

5.1 軟骨再生

目前，研究者們已進行了大量的動物實驗以及臨床前研究，證明了間充質(zhì)干細胞在軟骨修復中的有效性，且其療效大多數(shù)歸因于旁分泌途徑，特別是外泌體的分泌。Zhang 等［35］對大鼠股骨遠端向滑車溝上形成了骨軟骨缺損，術后在關節(jié)內(nèi)注射人胚胎間充質(zhì)干細胞外泌體100 μg 治療，術后組織學分析結果表明，外泌體處理組透明軟骨表面均一光滑，并與周圍軟骨融合充分；Zhang等［36］在隨后的介導的軟骨修復機制研究中發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞外泌體可通過增強軟骨細胞增殖能力、減少細胞程序性死亡和介導免疫反應來實現(xiàn)軟骨修復。

5.2 骨再生

骨再生是對成骨細胞、破骨細胞、骨細胞、軟骨細胞和內(nèi)皮細胞等不同類型細胞活動的時空協(xié)同調(diào)節(jié)。Furuta 及其團隊將間充質(zhì)干細胞外泌體作用于骨折小鼠模型，與對照組相比，實驗組骨折愈合所需時間較短［37］，證明干細胞外泌體有著良好的促進骨再生能力。與干細胞相比，外泌體更安全，取材更方便，目前已成為骨再生領域的研究熱點。Zhang 等［38］將β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）制成直徑5 mm、深2 mm、平均孔隙500 μm 的支架，無菌條件下將人骨髓間充質(zhì)干細胞來源的誘導多能干細胞（iPSCs）的外泌體涂抹在β-TCP 支架上，4 h 后吸收完全；然后將SD 大鼠麻醉后，用電鉆在顱骨兩側構建顱骨缺損；最后，將β-TCP 支架植入缺損區(qū)域內(nèi)，分為β-TCP 組、β-TCP+exos 組（外泌體濃度為5 × 1011個/mL、1012個/mL）。術后8 周，取顱骨經(jīng)組織學和免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)，與β-TCP 組相比，Exosome/β-TCP 復合支架組具有更強的成骨作用。體外實驗通過基因表達譜和生物信息學分析結果表明，Exosome/β-TCP 復合支架顯著改變了磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸激 酶（phosphatidylinositol - 3 - kinases/serine/threoninekinase，PI3K/AKT）信號通路相關基因網(wǎng)絡的表達。Jia 等［39］從大鼠內(nèi)皮祖細胞外泌體局部注射到大鼠牽張后脛骨間隙中，評價內(nèi)皮祖細胞外泌體對骨再生和血管生成的影響，結果表明外泌體通過刺激血管生成，促進了牽張成骨這一過程中的骨再生。因此，外泌體可大大提高牽張成骨治療骨缺損的質(zhì)量和減少臨床診治所需的時間。

5.3 皮膚再生

軟組織創(chuàng)傷治療過程中，如何防止瘢痕形成是一大難點。瘢痕形成是肉芽組織逐漸纖維化的過程，各類免疫細胞先后消失，毛細血管退化，僅存留少量小動脈及小靜脈。Hu 等［40］研究表明，脂肪間充質(zhì)干細胞外泌體可被成纖維細胞攝取內(nèi)化，在外泌體作用下成纖維細胞有著優(yōu)于對照組的增殖能力、遷移能力以及膠原生成能力。在小鼠背部造成1.5 cm × 1.0 cm 的皮膚缺損傷口，實驗組為靜脈注射以及局部注射脂肪間充質(zhì)干細胞外泌體，并以注射磷酸緩沖鹽溶液作為陽性對照組，陰性對照組則不做任何治療，在術后1、5、7、14、21 d的固定時間點采集背部創(chuàng)面閉合顯像。結果表明，實驗組較對照組（未治療組和磷酸鹽緩沖液處理組）創(chuàng)面閉合時間減少。靜脈注射組在術后7 d 傷口關閉50%，術后14 d 傷口關閉75%，術后21 d 傷口大部分關閉，約90%，且靜脈注射外泌體的效果優(yōu)于局部注射；靜脈注射治療組Ⅰ、Ⅲ型膠原兩種膠原含量最高，且在術后5 d 達到峰值。該研究證實，脂肪間充質(zhì)干細胞外泌體可以縮短小鼠皮膚切口創(chuàng)面愈合時間，并減少瘢痕形成，表明脂肪間充質(zhì)干細胞外泌體在軟組織傷口愈合過程中有著廣闊的臨床應用前景。Shi 等［41］利用脫乙酰甲殼素/絲素蛋白凝膠海綿作為牙齦間充質(zhì)干細胞外泌體的載體，研究其對糖尿病大鼠皮膚損傷恢復的效果，通過創(chuàng)面面積測定、組織學、免疫組織化學和免疫熒光分析等方法檢測，結果表明牙齦間充質(zhì)干細胞外泌體能在一定程度上加快糖尿病皮膚創(chuàng)面的修復。

5.4 血管再生

間充質(zhì)干細胞在誘導和促進血管生成中的作用機制還有待于進一步的研究，但其外泌體很有可能參與了這一過程，相關研究表明使用不含有外泌體的條件培養(yǎng)基會使血管生成過程受到影響［42］。隨著進一步的研究探討，發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長因子［43］或外泌體中的mRNA 及miRNA［44］與血管再生有著密切關系。因此，外泌體在血管再生領域也成為了一個新焦點。研究表明，核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號是間充質(zhì)干細胞外泌體在內(nèi)皮細胞血管生成中的主要調(diào)控者［45］。間充質(zhì)干細胞外泌體被人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)化后，內(nèi)皮細胞顯示出高于正常的增殖和遷移能力，且血管形成能力也有所提升，而新的血管形成是血管再生中的關鍵點。Anderson 等［45］相關研究證明間充質(zhì)干細胞外泌體的功能可能是由蛋白質(zhì)介導，而蛋白質(zhì)又受到微環(huán)境的影響。Anderson等［4-5］將間充質(zhì)干細胞置于外周動脈疾?。▌用}粥樣硬化導致的血管狹窄、阻塞的缺血性疾病等）樣微環(huán)境中，干細胞呈現(xiàn)多種血管生成相關蛋白如血小板衍生生長因子等高表達狀態(tài)。另外，研究結果進一步表明外周動脈疾病樣微環(huán)境對外泌體的分泌具有一個正向的促進作用，使其血管形成能力得到一定的提升，并證實了這一過程是通過NF-κB 通路實現(xiàn)的。miRNA 作為外泌體內(nèi)容物中一個重要的組成成分，也參與其中，可能是通過微調(diào)細胞的增殖、分化與歸巢來發(fā)揮作用的。其中，miRNA-6087 可調(diào)控內(nèi)皮細胞的分化；miRNA-222、miRNA-21 等可調(diào)節(jié)血管生成［46］。如何提高基于外泌體的“無細胞”治療的成血管效果，是外泌體應用于臨床研究的關鍵因素之一。同時，不同來源的間充質(zhì)干細胞所分泌的外泌體的成血管能力有所差別，在未來探索過程中需要科學家們花更多的精力去篩選出最適合用于血管再生的干細胞外泌體來源。另外，外泌體可以通過“改性”來優(yōu)化成血管性能，如負載成血管因子等。

5.5 味蕾再生

口腔癌近年來發(fā)病人群持續(xù)增多，其中舌癌較為多見。常規(guī)治療方法即通過外科手術切除癌變組織，后期以皮瓣移植修復缺損，這種治療方法雖然恢復了舌的形態(tài)，但無法恢復味覺功能等。Zhang 等［47］以大鼠舌缺損模型為研究對象，證明了將牙齦間充質(zhì)干細胞或其外泌體與小腸黏膜下層細胞外基質(zhì)聯(lián)合可促進舌乳頭再生。目前，仍需要更多的實驗來闡明干細胞及其外泌體在味蕾再生中的生物學機制，為當前口腔癌術后味蕾再生的治療提供一種新的治療思路，提升患者術后生活質(zhì)量。

5.6 神經(jīng)組織再生

外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)中也扮演著重要角色，可促進神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞間通訊，參與神經(jīng)元的發(fā)育、再生、突觸功能調(diào)節(jié)［48］和維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。牙髓干細胞具有獨特的神經(jīng)源性特性，本身即可表達巢蛋白等神經(jīng)標志蛋白。Jarmalaviciūte·等［49］研究表明乳牙牙髓干細胞外泌體，能夠抑制6-羥基-多巴胺誘導的人多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。隨后。越來越多的研究證實，外泌體對中風和神經(jīng)損傷后的神經(jīng)恢復有著非常重要作用。Zhang等［50］對大鼠外傷性腦損傷后采用骨髓間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生的外泌體進行治療，對腦損傷后的功能恢復十分有利，一方面促進血管重塑和神經(jīng)軸突生長及突觸發(fā)生，另一方面抑制神經(jīng)炎癥因子的產(chǎn)生。目前，大量動物實驗表明外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)中具有較好的修復作用，如外泌體可應用于脊髓損傷［51］、腦卒中［52］等。

5.7 牙再生

Jiang 等［53］研究發(fā)現(xiàn)牙齒發(fā)育過程中上皮-間充質(zhì)細胞外泌體可參與兩種細胞間發(fā)育誘導信號的傳遞過程，并且其所攜帶的信號的傳遞具有方向性、細胞特異性。上皮細胞外泌體誘導間充質(zhì)細胞產(chǎn)生牙本質(zhì)涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）并發(fā)生礦化，間充質(zhì)細胞外泌體誘導上皮細胞產(chǎn)生基底膜成分、成釉細胞蛋白和釉蛋白；反之，外泌體的衰減則導致基底膜形成的破壞和牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)形成的減少，并證實這一過程主要是由外泌體中攜載的miRNA-135a 激活Wnt 通路所實現(xiàn)的。Li 等［54］發(fā)現(xiàn)miR-133b 以外泌體形式傳遞到發(fā)育中的牙胚，對牙齒形態(tài)發(fā)生發(fā)揮調(diào)控作用。以上這些重大發(fā)現(xiàn)不僅補充了牙齒發(fā)育過程中的機制，同時也為外泌體應用于牙齒再生領域提供了堅實的理論基礎。Hu 等［55］從體外正常培養(yǎng)以及牙源性分化條件下培養(yǎng)的牙髓干細胞上清液中提取得到外泌體，分別命名為UN-Exo 和OD-Exo，通過Ion Torrent/MiSeq Sequencing 發(fā)現(xiàn)OD-Exo 中共28 種microRNA 發(fā)生了改變，其中7 種增加，21 種減少。體外實驗發(fā)現(xiàn)UN-Exo 處理牙髓干細胞后較對照組只提高了牙髓干細胞中DSP 的表達，而OD-Exo 被內(nèi)吞后則通過上調(diào)DSP、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentin matrix protein-1，DMP-1）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和Runt 相關轉錄因子2（runt-related transcription factor-2，RUNX2），觸發(fā)牙髓干細胞的牙源性分化。進一步的研究表明外泌體中的microRNA 可上調(diào)轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、轉化生長因子受體1（transforming growth factor receptor1，TGFR1）、p-Smad 2/3 和Smad 4 在牙髓干細胞中激活TGF-β1通路。

牙髓組織的不可逆損傷可由齲病、外傷、牙周炎逆行性感染等因素造成，主要治療手段是根管治療，但存在牙齒抗力下降、脆性大、易折斷等缺點。因此，保持牙齒活髓功能是維持牙齒生物學功能的關鍵。

Huang 等［56］利用牙源性條件下牙髓干細胞外泌體作用于牙髓干細胞以及骨髓間充質(zhì)干細胞，結果表明，牙髓干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞能夠以劑量依賴性和內(nèi)吞性可飽和的方式將外泌體內(nèi)吞，并激活p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated proteinkinases，p38 MAPK）通路以誘導干細胞分化和組織再生。另外，在體內(nèi)牙根切片模型上也證實了牙髓干細胞外泌體可以觸發(fā)牙髓樣組織的再生，并且在軟組織與牙本質(zhì)交界處DMP-1和DSP 表達顯著增強。綜上所述，研究表明外泌體可以作為誘導干細胞譜系特異性分化的仿生工具，同時，進一步表明了外泌體供體細胞的來源以及狀態(tài)對干細胞分化以及組織再生治療效果的重要性。Xian 及其團隊［57］證實了牙髓干細胞外泌體可增強血管內(nèi)皮細胞的增殖以及成血管能力，并驗證了該作用是通過p38 MAPK 信號通路實現(xiàn)的。血管生成對于感染牙髓和移植的牙髓組織的存活是不可缺少的過程，外泌體的促血管生成性能使得其在牙髓再生中展現(xiàn)出巨大潛能。

5.8 骨骼肌再生

Yoshihiro 等［58］將間充質(zhì)干細胞外泌體注入到由心肌毒素誘導的小鼠脛骨前肌損傷部位，以注射等量磷酸緩沖鹽溶液作為對照組，通過組織學相關評價證明了外泌體的確具備促進血管生成和肌肉再生的能力。同時，為了進一步探討外泌體促進肌肉再生的機制，對小鼠成肌細胞進行miRNA-494 基因轉染，以siRNA 作為對照，24 h 后發(fā)現(xiàn)小鼠成肌細胞出現(xiàn)了肌源性分化。因此，miRNA-494 很可能是外泌體促進骨骼肌再生過程中的媒介之一。目前，關于外泌體促進骨骼肌再生的相關分子生物學機制尚未完全了解，需要進行更多的研究去論證，為以后臨床應用打下堅實的臨床前實驗基礎。

5.9 心肌再生

心肌疾病是以心肌病變?yōu)楸憩F(xiàn)的一類疾病，在世界范圍內(nèi)有著高發(fā)病率和高死亡率。由于心肌受損后心臟再生能力下降，改善心臟功能成了一個較棘手的問題。干細胞外泌體為心肌疾病提供了一種有前景的治療方案。Wang 等［59］采用新生兒心肌細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的方法，體外觀察其外泌體分泌及其對細胞的作用，并采用大鼠模型比較心肌內(nèi)注射人骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞和人子宮內(nèi)膜來源間充質(zhì)干細胞的治療效果。結果表明，人子宮內(nèi)膜來源的間充質(zhì)干細胞較其余兩種干細胞具有更好的心臟保護作用，并增強了微血管密度；相關抑制劑研究發(fā)現(xiàn)，細胞治療的效果主要由外泌體中的miRNA-21介導，miRNA-21 進入受體細胞后，抑制下游靶點同源性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）從而增加蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）磷酸化，在細胞凋亡和血管生成中發(fā)揮重要作用。Bian 等［60］對Wistar 大鼠進行急性心肌梗死造模，造模成功后心肌內(nèi)注射人骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體，經(jīng)血流動力學分析、心臟功能評價等發(fā)現(xiàn)外泌體可以改善大鼠的血流恢復，并縮小梗死面積。Zhang等［61］相關研究表明，利用間充質(zhì)干細胞外泌體預處理，可促進心臟干細胞的增殖、遷移和血管新生，并在一定范圍內(nèi)促進效果隨外泌體濃度變化而出現(xiàn)改變。

5.10 肝臟組織再生

肝臟是人體消化系統(tǒng)中最大的器官，也是體內(nèi)少數(shù)幾個具有再生潛能的器官之一，它通過正常肝細胞的復制而再生。這種保護機制在肝損傷中有著重大意義，但是當損傷達到引起功能障礙的情況下，這種保護機制反而會導致更嚴重的結果，如出現(xiàn)急性肝功能衰竭等。肝病的病因有很多，且中國是乙肝高發(fā)地區(qū)，所以發(fā)掘一種有效的治療方法是大勢所趨。Tan 等［62］將間充質(zhì)干細胞外泌體經(jīng)脾內(nèi)注射于藥物性肝損傷小鼠模型，通過血清學及組織化學評價來評估肝損傷的治療效果，結果顯示外泌體可以改善肝損傷；隨后的對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）和過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）體外肝損傷模型研究結果表明，外泌體可以通過誘導位于靜止期（G0）的肝細胞在APAP 或H2O2誘導損傷后重新進入細胞周期（G1），從而調(diào)節(jié)肝細胞的增殖；同時，外泌體也可以增強G1 期轉錄因子的表達。Damania 等［63］將骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體作用于對乙酰氨基酚和過氧化氫體外肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)外泌體可以使肝損傷好轉；在動物實驗中也得出了相同的結論。Li等［64］利用人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體治療肝纖維化疾病模型，研究表明外泌體可阻斷TGF-β1/Smad途徑、抑制肝細胞上皮-間充質(zhì)轉化和膠原生成，從而減輕肝纖維化程度，為肝臟的再生提供了一種有前景的診療手段。

5.11 腎臟組織再生

Zhou 等［65］建立了順鉑誘導的大鼠急性腎損傷模型，經(jīng)腎包膜注射人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體，發(fā)現(xiàn)外泌體能夠有效抑制大鼠腎小管細胞的程序性死亡，提高腎小管細胞的分裂能力，且能夠逆轉由順鉑導致產(chǎn)生的腎氧化應激。同時，相關機制研究結果表明，外泌體主要通過激活細胞外調(diào)節(jié)蛋 白 激 酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）信號通路來發(fā)揮其作用，使受損細胞重新恢復增殖能力，從而達到腎損傷的修復作用。Koppen 等［66］對人胚胎間充質(zhì)干細胞衍生條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）對慢性腎病的保護作用展開了研究，結果表明CM 能使腎小管和腎小球損傷減輕、腎小球內(nèi)皮細胞增多，從而達到腎損傷修復的目的；然而，在相同條件下，單純采用人胚胎間充質(zhì)干細胞外泌體進行研究，發(fā)現(xiàn)對腎損傷并無任何保護效力。因此，腎組織的損傷修復對外泌體具有一定的選擇性，并不是所有細胞來源的外泌體均有治療效果，在未來的研究過程中需要廣大研究者們篩選出有效的外泌體來源，為腎病患者帶去福音。

5.12 肺組織再生

Li 等［67］采用小鼠肺缺血再灌注模型和體外低氧復氧模型，利用原代小鼠肺內(nèi)皮細胞研究間充質(zhì)干細胞外泌體是否能夠減輕肺缺血再灌注損傷，結果表明外泌體可以減輕肺水腫和功能障礙，并減少炎癥因子腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6 等的釋放，同時證實了外泌體可抑制肺上皮細胞內(nèi)源性和外源性凋亡途徑，改善細胞的程序性死亡，且依賴于miR-21-5p 的表達。Phinney 等［68］研究表明間充質(zhì)干細胞外泌體可通過其攜帶的miR-451 降低硅肺中腫瘤壞死因子mRNA 的表達以及蛋白的釋放，這一機制有可能將有利于肺組織受損后的再生。

6 小 結

干細胞外泌體目前在骨/軟骨組織修復、神經(jīng)組織再生、肝腎組織再生、肌肉組織修復、血管組織再生等領域均已進行了大量的臨床前期研究，展現(xiàn)了外泌體的再生潛能。外泌體能夠作為“無細胞治療”的手段之一，其中一個重要的方面是免疫調(diào)節(jié)作用。據(jù)報道，外泌體對體液免疫及細胞免疫均可產(chǎn)生強有力的影響，并有可能與損傷后組織修復及再生有關的抗炎、促炎功能有一定的關聯(lián)，而干細胞外泌體發(fā)揮組織修復及再生作用的關鍵就在于其能在適當?shù)臅r間促進抗炎、促炎這兩個完全相反的方面［69］。另一不可忽略的方面即外泌體在細胞間信號傳遞上起到的作用，外泌體可改變細胞的運動、增殖、表型變化和成熟［70］；亦可通過傳播保護或損傷信號來維持細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。外泌體介導某些特殊功能分子轉移，這些分子有可能將觸發(fā)受體細胞的促修復途徑［71］。通過瀏覽美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）臨床試驗網(wǎng)站，僅發(fā)現(xiàn)兩項關于外泌體促進組織再生的臨床試驗正在開展中，一項是關于外泌體治療腦卒中患者［72］，另一項是關于外泌體對黃斑裂孔的修復能力［73］。

當然，關于外泌體也還存在著一些問題，如外泌體提取方面，雖然超速離心法作為首選方法，但依然存在純度不高，容易造成外泌體崩解等缺點；一些商品化的試劑盒可提高外泌體的提取產(chǎn)量，但純度也在下降，仍需開發(fā)新的收集方法。另外，外泌體在組織修復和再生過程中的潛在作用尚未完全闡明，尚不清楚外泌體的哪些成分/性質(zhì)能夠促進組織再生，也不清楚用于治療的外泌體的量到底該如何衡量，過量的外泌體是否有可能造成不可逆的組織損傷?；谕饷隗w的治療是一種很有前途的治療手段，從干細胞中提取外泌體并加以純化和儲存，可以為未來各種疾病的治療以及組織再生提供一種全新的治療模式。當然，干細胞外泌體要真正應用于臨床實踐，還需要更多設計良好的臨床前期實驗和臨床隨機對照研究。