大鼠股骨、脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

郝宇鵬，謝艷，周英杰，柴旭斌，禚漢杰

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙；2.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院 河南省骨科醫(yī)院， 河南 洛陽(yáng))

0 引言

生長(zhǎng)板是一種動(dòng)態(tài)的高度分化的軟骨結(jié)構(gòu)，在軟骨內(nèi)骨化和骨的形成中發(fā)揮著重要的作用。軟骨細(xì)胞存在于關(guān)節(jié)軟骨中，具有增殖活性，負(fù)責(zé)分泌II 型膠原和其它類型的膠原以及非膠原的細(xì)胞外基質(zhì)大分子。成軟骨細(xì)胞的增殖和分化與脊椎動(dòng)物骨架的發(fā)育有著密切的關(guān)系。軟骨細(xì)胞能分泌和響應(yīng)一系列的生長(zhǎng)因子，包括IGF-1 和IL1。體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞是研究軟骨修復(fù)和關(guān)節(jié)炎病理的有用模型。

軟骨細(xì)胞培養(yǎng)一般取材于關(guān)節(jié)軟骨，肋軟骨，恥骨聯(lián)合等部位。利用大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)取材容易，但是存在由一個(gè)部位取材太少，不容易達(dá)到培養(yǎng)所需細(xì)胞用量的問(wèn)題。而且股骨和脛骨是關(guān)于生長(zhǎng)板相關(guān)疾病的重要發(fā)病部位，所以本文通過(guò)取大鼠股骨和脛骨關(guān)節(jié)軟骨，探索一種簡(jiǎn)便、可靠的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定方法，為骨關(guān)節(jié)疾病體外研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

iCell 原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系( 賽百慷( 上海) 生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)：Primed-icell-020)；胎牛血清( 美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)：1414426)；0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA，美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)：1734858)；0.1% Ⅱ型膠原酶(Gibco公司，貨號(hào)17101015)；多聚甲醛( 北京索萊寶科技有限公司，貨 號(hào)：P1110)；4'，6- 二 脒 基-2- 苯 基 吲 哚(DAPI)( 北 京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：C0060)；Triton X-100( 北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：T8200)；山羊血清( 北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：SL038)；兔Ⅱ型膠原一抗( 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：15943-1-AP)；Alexa Fluor 594 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：SA00006-4)；Fluoromount-G 熒光封片劑( 美國(guó)SourthernBiotech 公司，貨號(hào)：0100-01)。

1.1.2 主要儀器

生物安全柜(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：BSC-1500 ⅡA2-X)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱( 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)BC-J160S：)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon 公司，型號(hào)：DS-Ri2)；高速冷凍離心機(jī)( 美國(guó)Thermo Fisher 公司，型號(hào)：Multifuge ×1R)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：DHG-9123A)；電熱恒溫震蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：DK-2B)；T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Coming 公司，型號(hào)：430639)；血球計(jì)數(shù)板(德國(guó)Marienfeld 公司，型號(hào)：Neubauer improved)；24 孔板專用細(xì)胞爬片(北京索萊寶科技有限公司，型號(hào)：YA0350)；細(xì)胞培養(yǎng)孔板(上海臥宏生物科技有限公司，型號(hào)WHB-24)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞分離

圖1 大鼠股骨、脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)

培養(yǎng)取2 只4 周齡SD 大鼠，斷頸法處死，浸入75%乙醇中10 分鐘進(jìn)行消毒。無(wú)菌條件下用滅菌消毒后的眼科剪分別取出股骨及脛骨，去除肌肉及骨膜組織，分離生長(zhǎng)板軟骨。將收集的軟骨組織置于超凈工作臺(tái)中，剔除軟骨組織上的結(jié)締組織，清除沾染的血液污漬，置于培養(yǎng)基中，然后剪碎成約1mm3大小的碎塊，使用無(wú)菌磷酸緩沖鹽(PBS)清洗數(shù)次后加入0.1% Ⅱ型膠原酶與0.25% 胰蛋白酶20mL，置于37℃恒溫震蕩水槽中震蕩消化1.5h，中和，置離心機(jī)中1000r/min離心5min，棄上清液，收集組織，再加入0.1% Ⅱ型膠原酶20mL，于4℃過(guò)夜消化。取過(guò)夜消化的細(xì)胞懸液，吹打若干次，然后通過(guò)100μm 篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液移入離心管中，置離心機(jī)中1000r/min 離心5min，棄上清液，細(xì)胞沉淀重懸于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中，按5×105個(gè)細(xì)胞/瓶的密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2、飽和濕度95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每3 d 更換1 次。

1.2.2 軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)

觀察在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照記錄。

1.2.3 繪制軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

將制備的軟骨細(xì)胞懸液接種于96 孔板中，作為實(shí)驗(yàn)組?？瞻捉M以培養(yǎng)基代替細(xì)胞懸液，每孔0.2mL，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。收集第2 代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為每孔5×104個(gè)細(xì)胞，總共8 塊板，置CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，隔天換液，連續(xù)觀察8 天，24h 后開始計(jì)數(shù)，以后每隔24h 計(jì)數(shù)一次，每次取1 塊板，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每3 個(gè)復(fù)孔的平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)8d。每日取一塊培養(yǎng)板，每孔加入MTT(5g/L)20uL37℃孵育4h 后棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150U/孔，37℃溫浴10min。微量震蕩器震蕩培養(yǎng)板至結(jié)晶溶解，將空白對(duì)照調(diào)零，使用酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值(OD)值，以時(shí)間作為橫軸，光密度值作為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 軟骨細(xì)胞免疫熒光鑒定[1,2]

于24 孔板中放置3 片無(wú)菌蓋玻片，每孔加入培養(yǎng)基1mL，取分離獲得的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞，按2×104個(gè)/每孔的密度接種。培養(yǎng)過(guò)夜后將培養(yǎng)基吸出，PBS 清洗1 遍，加入4%多聚甲醛(PFA)于4℃固定30min，再用PBS 清洗3 次，每次5min。將蓋玻片除去水分，置于培養(yǎng)皿支撐物上，取50uL 破膜封閉液(0.5% Trition X-100 與PBS 1:1 混合，再加10%山羊血清)滴于防水膜上，蓋于玻片細(xì)胞面上透化2h；然后滴加50uL 兔Ⅱ型膠原一抗工作液(PBS 配置，一抗：PBS=1:100)，4℃孵育過(guò)夜，PBS 清洗3 次，每次5min；再滴加Alexa Fluor 594 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗工作液(PBS 配置，二抗：PBS=1:500)，室溫下避光孵育2h，PBS 清洗3 次，每次5min；最后滴加DAPI(DAPI:PBS=1:1000)染色5min，PBS 清洗3 次，每次5min 后，滴加Fluoromount-G 包埋，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞形態(tài)倒置

相差顯微鏡下觀察，剛接種的軟骨細(xì)胞為小圓球形，懸浮在培養(yǎng)液中，且細(xì)胞的體積大小相似，折光性較強(qiáng)，隨著培養(yǎng)，軟骨細(xì)胞逐漸增大，胞核與核仁也逐漸清晰。培養(yǎng)2 天后細(xì)胞開始逐漸貼壁，形態(tài)多呈圓形或橢圓形增大，伸長(zhǎng)形成偽足(圖2，A)。培養(yǎng)4 天后軟骨細(xì)胞呈扁平狀，不規(guī)則卵圓形或三角形，有成簇及重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象出現(xiàn)(圖2，B)。培養(yǎng)6 天后軟骨細(xì)胞90%融合形成單層，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈多邊形，星形等，胞體豐富，胞漿均勻，相互密集連接呈“鋪路石”狀外觀(圖2，C)。3 代后細(xì)胞大多為長(zhǎng)梭形，遮光性差。部分細(xì)胞由貼壁狀態(tài)脫落，懸浮于培養(yǎng)液中(圖2，D)。

圖2 生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞形態(tài)變化

2.2 軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞第1-3 天為生長(zhǎng)潛伏期，第4-6 天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6-7 天達(dá)到平臺(tái)期，從第7 天開始出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。見圖3。

2.3 軟骨細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果

Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞分泌的特異性膠原，可利用其免疫熒光對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在熒光倒置相差顯微鏡下，細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)出清晰紅色熒光(圖4B)，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后在不同波段熒光激發(fā)出藍(lán)色熒光(圖4，A)，表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)特征性Ⅱ型膠原，符合軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特征，證明本實(shí)驗(yàn)方法能夠分離培養(yǎng)出純度較高的軟骨細(xì)胞，可供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究使用。

圖3 第2 代生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖

圖4 生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞免疫熒光鑒定

3 討論

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞的功能活性要求都很高，但體外傳代培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的分裂增殖能力有限，隨傳代次數(shù)的增加會(huì)出現(xiàn)去分化及生物學(xué)功能活性衰退。因此，以有限的供體活組織收獲盡可能多而活性高的原代細(xì)胞，降低其體外擴(kuò)增，在組織工程的研究與臨床應(yīng)用中都非常重要。

生長(zhǎng)板軟骨由不含纖維血管組織，用酶把基質(zhì)消化后就可分離出大量高純度的軟骨細(xì)胞[1]。分離軟骨細(xì)胞應(yīng)用最多的是低質(zhì)量濃度的胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶順序染色消化法。胰蛋白酶對(duì)軟骨細(xì)胞外周基質(zhì)有較強(qiáng)的消化能力，可將大部分的蛋白多糖分解；Ⅱ型膠原酶可將膠原降解成低分子多肽短鏈物。本實(shí)驗(yàn)中先使用胰蛋白酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶消化除去軟骨細(xì)胞基質(zhì)及組織取材時(shí)可能帶入的雜質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)疏松軟骨顆粒的表面結(jié)構(gòu)，利于膠原酶發(fā)揮作用，再使用Ⅱ型膠原酶消化過(guò)夜，使基質(zhì)內(nèi)的膠原網(wǎng)架解離降解，隨后在機(jī)械的反復(fù)吹打下，便可分離出大量的軟骨細(xì)胞。

潘思年[4]、陳秋秋[5]等利用關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行培養(yǎng)，需要多只2-3 周齡的大鼠，所需大鼠數(shù)量比較多時(shí)增加了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，降低了軟骨細(xì)胞的存活率。我們用4 周齡SD 大鼠，取股骨和脛骨軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，僅需2 只大鼠即可，節(jié)約了試驗(yàn)時(shí)間和軟骨細(xì)胞的存活率。

生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞的共同特點(diǎn)，即可以合成和分泌包括膠原蛋白及蛋白聚糖在內(nèi)的多種基質(zhì)成分。膠原蛋白是關(guān)節(jié)軟骨的主要成分，其中以Ⅱ型膠原蛋白為主，占軟骨膠原總量的90%～95%，Ⅱ型膠原表達(dá)陽(yáng)性是軟骨細(xì)胞的特征性標(biāo)志[6]，可用于鑒定軟骨細(xì)胞。Alexa Fluor 染料為羅丹明或香豆素的衍生物，是一種含有活性基團(tuán)的有機(jī)熒光染料，具有激發(fā)光譜窄、發(fā)射光譜寬、量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好，以及受溫度、pH 影響小等優(yōu)點(diǎn)[7]。與傳統(tǒng)的熒光團(tuán)相比，Alexa Fluor 激發(fā)的熒光具有發(fā)光亮度更強(qiáng)，靈敏度更高，背景更低，因此更適合于拍照。本實(shí)驗(yàn)選用Alexa Fluor 594 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)作為二抗，經(jīng)熒光激發(fā)后細(xì)胞呈現(xiàn)清晰紅色，證明了本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。