黃腐酸在防治葡萄果實采后灰霉病中的應用

一、基本信息

1.專利號：ZL201010267273.4。

2.發(fā)明人：高靈旺、徐丹丹、習平根、于戈、姜子德、王琦、李文明、香梅、趙糧。

3.專利權人：中國農業(yè)大學。

4.授權時間：2018年6月8日。

5.技術領域：本發(fā)明涉及一種黃腐酸在防治葡萄采后灰霉病中的應用，屬于生物技術領域。

二、發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供黃腐酸在葡萄采后灰霉病防治中的應用，黃腐酸能夠防治灰霉病菌侵染的果實，對果實病害發(fā)生和病情擴展具有顯著防治效果。

本發(fā)明首先提供了黃腐酸在防治葡萄采后灰霉病中的應用。

具體應用中，將灰霉病菌侵染前或侵染后的葡萄浸泡于黃腐酸水溶液中。所述黃腐酸水溶液的質量體積濃度可為0～20 mg/mL，但不為零，如10 mg/mL；所述黃腐酸能夠防治灰霉病，具體表現(xiàn)為提高葡萄中多酚的含量。

本發(fā)明還進一步提供了一種防治葡萄采后灰霉病的方法，包括如下步驟：

將灰霉病菌侵染前或侵染后的葡萄浸泡于黃腐酸水溶液，即實現(xiàn)對葡萄采后灰霉病的防治。所述黃腐酸水溶液的質量體積濃度可為0～20 mg/mL，但不為零，如10 mg/mL。

本發(fā)明通過選用不同濃度的黃腐酸溶液處理葡萄果實，然后接種灰霉病菌（Botrytis cinerea）。實驗結果表明：黃腐酸處理后的葡萄果實灰霉病發(fā)生度顯著下降；另外，通過在離體條件下選取黃腐酸處理葡萄灰霉病菌發(fā)現(xiàn)黃腐酸處理對病原菌的生長無影響，因此初步斷定黃腐酸是通過誘導植物本身的抗性來達到防病的效果；最后，黃腐酸處理葡萄果實后提取果實的多酚總含量，發(fā)現(xiàn)多酚含量顯著提升。結合黃腐酸的防效、多酚的抑菌活性及有益于人體健康，認為黃腐酸防治葡萄采后灰霉病的方法可行。

本發(fā)明采用的黃腐酸物質可用于葡萄采后灰霉病的防治，既可以單獨使用，也可以與其他活性物質聯(lián)合使用，以增強抗菌效果或降低其毒副作用，黃腐酸具有綠色、安全的特點，有益于人體健康，符合食品安全要求，起到了防治灰霉病及對果品的保鮮作用。

具體實施方式如下：

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到；下述實施例中所用的供試病原菌：供試葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea均分離于發(fā)病的葡萄果實，保存于馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）上；下述實施例中所用的黃腐酸試劑購自麥克林生化科技有限公司，純度為85%。

實施例1：黃腐酸對采后葡萄灰霉病的防效實驗

供試材料：供試葡萄品種“馬奶”，購自市場。

將單粒葡萄果實人工分離，留有果蒂，選取大小、形狀、成熟度一致的健康果粒于2%的次氯酸鈉溶液中消毒2 min，然后用無菌水沖洗2次，晾干后分組處理。

（1）將葡萄果實分別置于不同濃度的黃腐酸溶液中浸泡10 min，每個濃度處理設置3個重復，每個重復處理30顆果實。

（2）自然晾干果實后將所有果實置于22 ℃下放置24 h。

（3）分別將葡萄灰霉病菌于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，然后在平板中加入無菌水沖洗和振蕩，配制孢子懸浮液（濃度為3×104個/毫升）。

（4）人工刺傷果實，在傷口處接入10 μL的灰霉病菌孢子懸浮液。

（5）將各濃度處理的果實分別置于塑料保鮮盒中，噴霧保濕，置于22 ℃貯藏。

（6）貯藏4天和6天后，觀察并記錄果實的發(fā)病率及病斑直徑，并計算其抑制率。抑制率（%）＝[（A-B）/A]×100，A為對照組發(fā)病率/病斑直徑，B為處理組發(fā)病率/病斑直徑。

實驗結果表明：黃腐酸對葡萄灰霉病有很好的防效，且隨著濃度的升高防效提高。供試濃度為10 mg/mL時，貯藏6天后對果實發(fā)病率的抑制率達到29.9%，對病斑直徑的抑制效果高達42.6%。當黃腐酸的濃度為20 mg/mL時，貯藏6天后對果實發(fā)病率的抑制率達到61%，對病斑直徑的抑制效果高達54%。

實施例2：黃腐酸對葡萄灰霉病菌菌絲生長的影響

用無菌去離子水溶解黃腐酸，然后分別加入至PDA培養(yǎng)基中配置成含有黃腐酸的培養(yǎng)基，以菌絲生長速率法測定不同濃度黃腐酸對病原菌菌絲生長的抑制作用。具體步驟如下：

用無菌去離子水作為溶劑溶解黃腐酸配置成母液，然后分別準確加入一定量的黃腐酸溶液至50 ℃融化的PDA培養(yǎng)基中混勻，使得培養(yǎng)基中黃腐酸的終濃度分別達到0.1、0.5、1、10和50 mg/mL，每個濃度處理設置3個重復，以加入相同體積的無菌去離子水作為對照。供試的葡萄灰霉病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后，用滅菌打孔器在活化的病原菌菌落邊緣打取菌齡、直徑大小一致的菌餅（d＝6 mm），反接入含藥平板中央，于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察記錄實驗結果。

實驗結果表明：黃腐酸不影響葡萄灰霉病菌的菌絲生長，當黃腐酸濃度為50 mg/mL時，葡萄灰霉病菌的菌絲生長直徑與對照無顯著差異。

實施例3：黃腐酸對葡萄果實多酚含量的影響

用無菌去離子水溶解黃腐酸使其終濃度達到10 mg/mL，將葡萄果實于黃腐酸溶液中浸泡10 min后取出晾干，以相同體積的去離子水處理葡萄果實作為試驗對照。于22 ℃下放置24 h后，參照實施例1的方法接種葡萄灰霉病菌孢子懸浮液，然后置于22 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)，每隔12 h定期對各處理的葡萄果實取樣，以備多酚物質含量的提取測定。

葡萄果皮多酚總含量的提取測定方法如下：人工從取樣的葡萄果實上分離果皮，用濾紙吸干水分，于液氮中速凍并研磨果皮至粉末，加入8 mL 80%甲醇溶液進行多酚的提取。將提取液于28 ℃下震蕩混勻（200 rpm）90 min，于4 ℃下離心（12000 g）10 min，搜集上清，作為多酚物質的粗提液。多酚總含量的測定采用福林-酚比色法，加入184 μL水至24 μL粗提液中，然后加入12 μL福林-酚溶液，室溫下放置3 min，加入30 μL 20%的Na2CO3溶液，40 ℃下放置2 h后于765 nm下測定吸光度。以沒食子酸為標樣繪制標準曲線，進而求得提取液的多酚總含量。

實驗結果表明：黃腐酸處理提升了葡萄果皮的多酚總含量，且隨著病原菌接種時間的延長，多酚總含量呈上升趨勢；當病原菌接種36 h后，黃腐酸處理下多酚總含量最高。

三、背景技術

葡萄是一種重要的經(jīng)濟作物，其用途涉及釀酒、鮮食及果干等方面，與國民經(jīng)濟的發(fā)展及人身健康密切相關。但是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引發(fā)的灰霉病作為一種重要的植物病害，在葡萄上主要危害葡萄花穗及果實，引發(fā)落花、落果及果實腐爛，嚴重影響了葡萄的采后儲運，限制了葡萄產業(yè)的發(fā)展。

目前在葡萄的采后處理上，主要是通過SO2熏蒸來達到防治病蟲害的目的，但是由此引發(fā)的果實品質的改變及SO2殘留對人身的危害等問題不容忽視。因此，迫切需要探索新型的替代方法來防治葡萄采后灰霉病。

植物的誘導抗性防治主要是通過體外噴施各種誘導劑提高作物本身對外界逆境及病蟲害的抗性，常見的誘導劑有Si、殼聚糖和一些生防菌劑等。黃腐酸作為腐植酸中一類可溶于水的物質，在農業(yè)生產上因其可作為土壤施用肥料改善土壤性質、提高作物產量和增強作物抗性等卓越性能而備受關注，其中常見的黃腐酸肥有黃腐酸鉀和黃腐酸鈉。另外，黃腐酸作為醫(yī)藥行業(yè)常用的藥劑輔劑，對胃腸炎、風濕病和關節(jié)炎等均具有一定的療效，有益于人類的健康。