超聲波輔助法提取南非葉多酚的工藝研究

陳文娟，韓 穎，陳建福

(1.漳州城市職業(yè)學(xué)院 食品工程系，福建漳州363000;2.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院 陜西 西安 710062;3.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品工程學(xué)院，福建 漳州363000)

南非葉(VernoniaamygdalinaDel)又名神奇葉、苦茶葉、桃葉斑鳩菊等，在我國(guó)又被稱為“將軍葉”，屬于灌木類或小喬木類植物[1].南非葉生長(zhǎng)能力強(qiáng)，四季皆宜種，簡(jiǎn)單扦插法即可成活，是一種極具藥理研究?jī)r(jià)值的植物，在非洲被當(dāng)做一種蔬菜，常應(yīng)用于日常保健[2-3].南非葉富含黃酮、生物堿、多酚、倍半萜類等多種天然有效成分，能起到清血、涼血的作用，同時(shí)具有降血糖、血脂及抗氧化等多種生理功能[4].植物多酚是一種存在于植物的葉、根、皮、果實(shí)中的一種多羥基酚類化合物，具有抗氧化、抗菌、抗癌、抑制心血管疾病、調(diào)血脂和降血糖等多方面的生理功能[5-6].為提高南非葉資源的利用率，以南非葉為原料，選用超聲波輔助法提取其中的多酚，對(duì)液料比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的提取工藝，為南非葉資源的開(kāi)發(fā)提供新的方向.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南非葉，采于漳州馬鞍山.將采摘的南非葉用清水洗凈，去除泥沙，曬干表面水分，置于 50 ℃ 鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎成細(xì)粉末備用.福林酚試劑，自制；沒(méi)食子酸(分析純，天津瑞金物理化學(xué)品有限公司)；乙醇(食品醫(yī)藥級(jí)，河南省浩宇食品添加劑有限公司)；其它所用試劑均為分析純.

提取過(guò)程使用昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器；吸光光度測(cè)試過(guò)程使用上海市美普達(dá)儀器有限公司生產(chǎn)的UV-200型可見(jiàn)/紫外分光光度計(jì).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用福林-酚法[7]，向7個(gè) 10 mL 容量瓶中移取質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，體積依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、和 1.2 mL，再將 0.5 mL 福林-酚試劑順次加入，緩慢混勻，靜置約 1 min，再向各容量瓶移入 1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，定容至 10 mL，用試管架固定于水浴鍋中，在 75 ℃ 反應(yīng) 10 min，取出冷卻后，使用預(yù)先設(shè)置波長(zhǎng)為 765 nm 的分光光度計(jì)中測(cè)定吸光度值.以沒(méi)食子酸濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得y= 0.102 3x-0.029 7，R2=0.999 2.

1.2.2 南非葉多酚的提取及含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱量 1.000 0 g 的南非葉粉末，緩慢放入 100 mL 圓底燒瓶，加入一定量乙醇(體積分?jǐn)?shù))，按規(guī)定時(shí)間在超聲波儀器中進(jìn)行提取，提取完成后，靜置至冷卻.過(guò)濾、定容，后取 1 mL 提取液，按1.2.1中方法，測(cè)定吸光度.

多酚提取率(mg/g)= (C×N×V)/M

式中：C為南非葉多酚質(zhì)量濃度(mg/L)；V為提取液體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為南非葉質(zhì)量(g).

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取 1.000 0 g 的南非葉粉末，緩慢裝入 100 mL 的圓底燒瓶中，加入 30 mL 65%的乙醇，在 60 ℃ 的超聲波儀器中分別浸提20、25、30、35和 40 min，取出燒瓶，靜置至冷卻，定容，研究對(duì)南非葉多酚提取率的影響，確定最佳超聲時(shí)間.

準(zhǔn)確稱取 1.000 0 g 的南非葉粉末，緩慢裝入 100 mL 的圓底燒瓶中，加入 30 mL 乙醇，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為55%、60%、65%、70%和75%，設(shè)置超聲溫度 60 ℃，固定燒瓶，浸提 30 min，取出，靜置至冷卻，定容，研究不同乙醇濃度下對(duì)南非葉多酚提取率的影響，確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù).

準(zhǔn)確稱取 1.000 0 g 的南非葉粉末，緩慢裝入 100 mL 的圓底燒瓶中，分別加入20、25、30、35和 40 mL 體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液，設(shè)置超聲溫度 60 ℃，固定燒瓶，浸提 30 min，取出，靜置至冷卻，定容，研究不同液料比對(duì)南非葉多酚提取率的影響，確定最佳液料比.

準(zhǔn)確稱取 1.000 0 g 的南非葉粉末，緩慢裝入 100 mL 的圓底燒瓶中，加入 30 mL 體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇，分別在55、60、65、70和75 ℃ 的超聲波儀器中浸提 30 min，取出，靜置至冷卻，使定容，研究不同超聲溫度對(duì)南非葉多酚提取率的影響，確定最佳超聲溫度.

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取 1.000 0 g 南非葉粉末，在液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和超聲溫度4個(gè)單因條件下(表1)，確定每個(gè)提取因素的變化范圍，得到各因素的適應(yīng)值.在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken Design軟件，根據(jù)設(shè)計(jì)原理，各自變量選取3個(gè)水平，采用-1、0、1進(jìn)行編碼，以南非葉多酚提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案.

表1 響應(yīng)面分析各因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 南非葉多酚提取率的影響因素

2.1.1 液料比對(duì)南非葉多酚提取率的影響

由圖1中可知，當(dāng)液料比上升至 30 mL/g 時(shí)，南非葉多酚的提取率處于最高點(diǎn)，這是由于隨著液料比的升高，南非葉多酚提取系統(tǒng)中溶劑含量增加，促使提取過(guò)程傳質(zhì)推動(dòng)力增大，進(jìn)而提取率增大，但當(dāng)液料比超過(guò) 30 mL/g 后，溶劑過(guò)多，導(dǎo)致增大了過(guò)濾等操作中多酚含量的損失[8]，造成提取率下降，由此選擇液料比 30 mL/g 為宜.

圖1 液料比對(duì)南非葉多酚提取率的影響

2.1.2 乙醇濃度對(duì)南非葉多酚提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度上升到65%時(shí)，南非葉多酚提取率處于最高點(diǎn)，這是由于在植物體內(nèi)，氫鍵通常作為多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等結(jié)合的橋梁，隨乙醇濃度的提高，氫鍵斷裂加速，多酚在乙醇中的溶解度增加，導(dǎo)致提取率增大[9].但當(dāng)乙醇濃度超過(guò)65%后，溶劑極性被減弱，南非葉粉末中多酚類物質(zhì)受醇溶性雜質(zhì)影響，溶出被抑制，造成多酚提取率下降，由此選擇乙醇濃度65%為宜.

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)南非葉多酚提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)超聲時(shí)間延長(zhǎng)到 30 min 時(shí)，南非葉多酚提取率處于最高點(diǎn)，這是由于液料接觸時(shí)間越長(zhǎng)越利于南非葉中多酚的溶出，但當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò) 30 min 時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，多酚物質(zhì)易被氧化破壞，最終結(jié)果為提取率下降，故超聲時(shí)間選取 30 min 為宜.

圖3 超聲時(shí)間對(duì)南非葉多酚提取率的影響

2.1.4 超聲溫度對(duì)南非葉多酚提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)超聲溫度上升到 60 ℃ 時(shí)，南非葉多酚提取率達(dá)到峰值，這是由于伴隨溫度升高，提取系統(tǒng)中分子運(yùn)動(dòng)平均自由程增大，加速南非葉粉末中多酚類物質(zhì)溶出，多酚提取率增大，但當(dāng)超聲溫度超過(guò) 60 ℃時(shí)，系統(tǒng)溫度過(guò)高，多酚分子受到氧化破壞，使得多酚提取率下降[10]，由此得最佳提取溫度為 60 ℃.

2.2 南非葉多酚提取的響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

以南非葉多酚提取率為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.05b軟件，分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)的Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案，結(jié)果與方差結(jié)果如表2、表3所示.

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) mg/g

續(xù)表

表3 回歸方程方差分析

依據(jù)表2，選用液料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲時(shí)間(C)和超聲溫度(D)作為自變量，以南非葉多酚提取率(Y)為響應(yīng)值，建立四元二次回歸模型：

Y=20.32-0.027A-0.041B+0.076C-0.30D-0.12AB-0.052AC-0.47AD-0.1BC+0.47BD-0.22 CD -1.57A2-1.16B2-0.5C2-0.81D2

通過(guò)對(duì)南非葉多酚提取所得數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，以檢驗(yàn)所得試驗(yàn)方程的可靠性與有效性.表3顯示，南非葉多酚提取率為響應(yīng)值時(shí)，回歸模型極顯著(p<0.000 1)；同時(shí)失擬度(p= 0.211 5)，說(shuō)明回歸方程失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，證明其余的未知因素對(duì)結(jié)果影響非常小.相關(guān)系數(shù)R2= 0.909 2，表明該二次模型方程反映的試驗(yàn)值具有較好的可靠性與真實(shí)性.所得模型方程與實(shí)際情況擬合較好，能夠清晰的反映南非葉多酚提取率同4個(gè)因素間的關(guān)系，從而可證明該四元二次回歸方程能夠較好的預(yù)測(cè)南非葉多酚提取率如何隨各因素的變化而變化.

由表3中不同模型的P值得，除二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響差異極顯著，一次項(xiàng)D與交互項(xiàng)AD、BD為顯著，其余項(xiàng)影響差異均不顯著.說(shuō)明在單因素中，超聲溫度是南非葉多酚提取率的主要影響因素，液料比的影響最弱.各交互作用中，乙醇濃度與超聲溫度間交互作用最顯著.由表3中F值得，南非多酚提取率受不同因素影響比為：超聲溫度>超聲時(shí)間>乙醇濃度>液料比.綜合以上各試驗(yàn)參數(shù)能夠證明此試驗(yàn)方法的可靠性，故為了較真實(shí)的分析結(jié)果，可選擇使用該回歸模型.

2.2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的曲面圖分析

響應(yīng)曲面圖是響應(yīng)值(多酚提取率)與A、B、C、D四因素之間關(guān)系繪制成的三維空間曲面圖，觀察各曲面圖可得到各參數(shù)及最優(yōu)參數(shù)間的相互作用.當(dāng)特征值均為正且存在極小值時(shí)，響應(yīng)曲面圖為山谷形，當(dāng)特征值均為負(fù)且存在極大值時(shí)，響應(yīng)曲面圖為山丘形，當(dāng)特征值有正有負(fù)且無(wú)極值時(shí)，響應(yīng)曲面圖為馬鞍形.同時(shí)據(jù)回歸方程可得出各個(gè)因子的響應(yīng)曲面圖及相應(yīng)的等值線圖，從而分析各因素間的交互作用對(duì)南非葉多酚提取率效果的影響.采取Design Expert 8.05b軟件，繪制出各交互作用的響應(yīng)曲面圖，如圖5所示.

圖5 各因素之間交互作用的影響

結(jié)合三維響應(yīng)曲面與二維等高線可分析出幾個(gè)自變量對(duì)響應(yīng)值的影響情況，響應(yīng)面圖形的曲線越陡，等高線的橢圓形離心率越大，表明其交互效應(yīng)越顯著.由圖5可得，液料比為定值時(shí)，適當(dāng)提高超聲溫度有利于多酚的提??；當(dāng)超聲溫度為定值時(shí)，多酚提取率隨液料比增加逐漸增加，提取率在液料比為 35 mL/g 時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)若再增大液料比，多酚提取率反而逐漸下降，從而得出兩因素間交互作用顯著.另外當(dāng)乙醇濃度為定值時(shí)，在一定范圍內(nèi)提高超聲溫度引起多酚物質(zhì)的溶出加快，但過(guò)高的溫度會(huì)破壞多酚物質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率下降；當(dāng)超聲溫度為定值時(shí)，隨乙醇濃度增加，多酚提取率變化趨勢(shì)為先升后降.超聲溫度在60～65 ℃ 時(shí)軸向的等高線較密集，則表明，乙醇濃濃度和超聲溫度間交互作用顯著.其他交互作用對(duì)南非葉多酚提取率影響不顯著(p>0.05)圖略去.

2.2.4 最優(yōu)工藝條件驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析，得到提取南非葉多酚最佳工藝條件為：液料比為 30.13 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)為64.64%，超聲時(shí)間 30.66 min，超聲溫度為 58.84 ℃，理論預(yù)測(cè)提取率為 20.36 mg/g.為使操作便利，修正實(shí)驗(yàn)條件為：料液比 30 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，超聲時(shí)間 31 min 和超聲溫度 59 ℃，在此條件下提取南非葉中多酚，得到的實(shí)際提取率為 20.33 mg/g，相比理論預(yù)測(cè)值 20.36 mg/g，算得相對(duì)誤差僅為0.15%，表明該模型具有較好的可靠性與準(zhǔn)確性，可為南非葉中多酚提取的實(shí)際操作提供參考.

3 結(jié)語(yǔ)

1) 以南非葉為原料，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并通過(guò)響應(yīng)面分析，得到影響南非葉多酚提取率的四元二次回歸方程：

Y=20.32-0.027A-0.041B+0.076C-0.30D-0.12AB-0.052AC-0.47AD-0.1BC+0.47BD-0.22CD -1.57A2-1.16B2-0.5C2-0.81D2，該數(shù)據(jù)模型具有較高的準(zhǔn)確度和可信度，可作為南非葉多酚提取分析及預(yù)測(cè)的依據(jù).

2) 南非葉多酚最佳提取工藝為：液料比 30 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，超聲時(shí)間 31 min和超聲溫度為 59 ℃，南非葉多酚提取率為 20.33 mg/g，相比預(yù)測(cè)值(20.36 mg/g)，算得相對(duì)誤差僅0.15%，表明該模型可靠性較高，試驗(yàn)得出的多酚提取工藝富有良好的實(shí)用價(jià)值，為南非葉多酚的提取及開(kāi)發(fā)提供新的研究方向.