云南省禽腺病毒檢測與分子流行病學(xué)調(diào)查

向文彬，陳俊宏,2，嚴(yán)紅亞，李珂，覃袖偉，趙蓉，李會,2，信愛國*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所，云南 昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

包涵體肝炎性-心包積水綜合征(Inclusion body hepatitis-hydropericardial syndrome，IBH-HPS)是由禽腺病毒(Fowladenovirus，F(xiàn)AdV)引起的一種嚴(yán)重危害禽類養(yǎng)殖的疾病，尤其是3～6周齡的肉雞，其發(fā)病突然，死亡率高，一般為20%～70%，病理解剖可見典型的心包積液和肝臟腫大出血[1，2]。本病既可橫向傳播又可垂直傳播，其傳播的主要途徑是通過糞口途徑。被感染禽類的肝臟在顯微鏡下顯示肝細(xì)胞中有明顯壞死灶和嗜堿性核內(nèi)包涵體[2]。根據(jù)當(dāng)前病毒分類系統(tǒng)，禽腺病毒可分為3個亞群，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群。Ⅰ群禽腺病毒根據(jù)限制性內(nèi)切酶酶切分析可分為5個型，即FAdV-A～FAdV-E；根據(jù)血清交叉中和實(shí)驗(yàn)可分為12個血清型，即FAdV-1～FAdV-8a、FAdV-8b～FAdV-11。Ⅱ群禽腺病毒包括火雞出血性腸炎病毒、雉雞大理石脾病毒和禽類脾腫大病毒。Ⅲ群禽腺病毒僅包含減蛋綜合征病毒(Eggdropsyndromevirus，EDSV)[2，3]。最常見的是Ⅰ群禽腺病毒中的FAdV-4型感染。在國內(nèi)該病先后出現(xiàn)在遼寧、安徽、山東、浙江等地[4]，最近幾年也在西南地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)[5]。目前，云南省禽腺病毒流行情況尚缺乏相關(guān)報(bào)道和調(diào)查，本次流行病學(xué)調(diào)查可為今后云南省禽腺病毒的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和DL2000 DNA Marker購自天根生化科技有限公司，rTaq酶購自上海捷瑞生物工程有限公司,瓊脂糖購自上海斯信生物科技有限公司。電泳儀購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 病料來源

對來自云南省內(nèi)疑似禽腺病毒感染的發(fā)病禽類進(jìn)行剖檢，采取心臟、肝臟、脾臟、心包積液等組織樣品共50份，送至云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分子生物學(xué)檢測及基因序列測定與分析。

1.3 臨床剖檢

將病死禽進(jìn)行臨床解剖后觀察其病理變化。

1.4 PCR檢測

根據(jù)GenBank中收錄的FAdV全基因組序列，針對病毒的Hexon基因的保守序列設(shè)計(jì)合成了1對特異性引物用于病毒檢測及分子流行病學(xué)研究。引物序列為上游F：5′-ATGTCAGCAGTAGGCGAT-3′，下游R：5′-GCCGTCGCTCTAAGGGTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增1218bp，引物由擎科生物公司合成。對臨床采集樣品進(jìn)行PCR檢測。檢測反應(yīng)體系為25μL：rTaq酶12.5μL，ddH2O10.5μL，DNA模板1μL，上游引物、下游引物各0.5μL；PCR反應(yīng)條件為94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，60s，35個循環(huán)；72℃，7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 Hexon基因的同源性比較和聚類分析

將陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行Hexon基因序列測定，并用Vector NTI 8 軟件拼接，從GenBank下載有關(guān)禽腺病毒的相關(guān)序列作為參考毒株(見表1)，采用MEGA 6.0軟件，進(jìn)行同源性比較和聚類分析。

表1 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 臨床剖檢結(jié)果

臨床解剖可見病死雞心包積液，心包囊中積聚無色或琥珀綠色，水狀或果凍狀液體，心包整個呈現(xiàn)透明水荔枝狀的形態(tài)，其內(nèi)大約有10～30mL液體，心臟出現(xiàn)畸形和凹陷，心尖在心包囊中浮起，心包脂肪顯示出淡黃色變色和瘀血；肝臟極度腫大，質(zhì)脆易碎，有大面積的局灶性壞死斑塊和上皮出血；脾臟腫大；肺臟瘀血、水腫；腸道出血；雞胃角質(zhì)層糜爛。

2.2 PCR結(jié)果

經(jīng)PCR檢測的所有樣品中有3個可擴(kuò)增出Hexon片段(1211bp)，禽腺病毒核酸檢測陽性，見圖1、圖2。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1.陽性對照；2.陰性對照；3.FAdV-D11 YN20191128DUCK；4～7.樣品。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1.陽性對照；2.陰性對照；3.FAdV-C4 YN20200320；4.FAdV-E8YN20191031；5～7.樣品。

2.3 Hexon基因序列測定與結(jié)果分析

通過Vector NTI 8軟件進(jìn)行序列拼接，然后使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹比對測序結(jié)果。結(jié)果顯示，檢測的樣品中編號YN20191128 FAdV-D樣品與D11血清型參考毒株序列同源性為100%，編號YN20200320 FAdV-C樣品與C4血清型參考毒株序列同源性為99.67%，編號YN20191031 FAdV-E樣品與血清型為E8b參考毒株序列同源性為99%。說明目前的檢測范圍中云南省流行的禽腺病毒毒株主要為C4型、D11型、E8b型(結(jié)果見圖3)；暫未發(fā)現(xiàn)其他血清型毒株。

3 討論

禽腺病毒最早于20世紀(jì)70年代中期在我國臺灣省出現(xiàn)，其主要流行型以血清Ⅰ型為主，臨床癥狀不典型，病理學(xué)變化多為心包積液和包涵體肝炎。隨著病毒的傳播與突變，禽腺病毒感染已經(jīng)成為當(dāng)前養(yǎng)禽業(yè)疾病防控中不可忽視的一個重要問題。本次對云南省禽腺病毒流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)云南省養(yǎng)禽業(yè)存在禽腺病毒，并呈流行趨勢，主要流行毒株基因型集中為FAdV-C4型、FAdV-D11型、FAdV-E8型，其中FAdV-D11型主要存在于鴨類，其他流行毒株存在于土雜雞和商品代蛋雞。將繼續(xù)對云南省內(nèi)的禽腺病毒流行情況進(jìn)行跟蹤調(diào)查。

臨床剖檢方面，若病死禽出現(xiàn)典型心包積液與肝炎癥狀可懷疑為Ⅰ型禽腺病毒感染；若蛋禽出現(xiàn)明顯產(chǎn)蛋下降并排除細(xì)菌類感染、新城疫等疾病時可懷疑Ⅲ型禽腺病毒感染，但若要確診仍然需要進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。

通過對PCR陽性產(chǎn)物的Hexon基因序列對比分析后發(fā)現(xiàn)，云南省流行的禽腺病毒主要是FAdV-C4型，通過對比GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)參考毒株，與我國山東以及加拿大分離株的同源性高達(dá)99.67%。當(dāng)然禽腺病毒的隱性感染率很高，這對普通的分子生物學(xué)檢測方法也造成了不可避免的誤差[6]。

禽腺病毒在云南省內(nèi)的流行已經(jīng)不局限于偶發(fā)性發(fā)病，這提示在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)該從阻斷傳染源、切斷傳播途徑方向入手，在引進(jìn)種禽時必須建立嚴(yán)格的隔離凈化制度[7]，將新引入的種禽分群在距離原先禽舍較遠(yuǎn)的地方進(jìn)行隔離觀察飼養(yǎng)，有條件的應(yīng)該進(jìn)行全面血清學(xué)檢測，如檢測中遇到陽性群體應(yīng)將其單獨(dú)隔離進(jìn)行飼養(yǎng)管理，并安全銷毀病死禽。對未患病禽進(jìn)行免疫預(yù)防，平時應(yīng)該嚴(yán)格執(zhí)行衛(wèi)生消毒工作，對圈舍、飼料和飲水進(jìn)行徹底的消毒，因?yàn)槿缙渌膊“榘l(fā)時容易引起相關(guān)的免疫抑制病，從而引起交叉感染加劇病情惡化程度[8]。

目前，市面上也有很多關(guān)于禽腺病毒的疫苗，如油乳劑細(xì)胞滅活苗、全病毒滅活疫苗、弱毒滅活苗和亞單位疫苗[9]。選擇與流行毒株基因型相匹配的油乳劑細(xì)胞滅活苗，對該病也能較好保護(hù)，且這種保護(hù)作用能傳遞給免疫禽的子代，對免疫禽及其子代的保護(hù)率分別達(dá)到100%和90%[10]。除此以外，還需要對原種場、祖代場等進(jìn)行禽腺病毒的凈化，才能有效地切斷傳播途徑，減少該病毒的感染。

圖3 禽腺病毒核酸序列的進(jìn)化樹