灌漿初期高溫影響水稻籽粒碳氮代謝的機(jī)理*

王軍可，王亞梁，陳惠哲，向 鏡，張義凱，朱德峰，張玉屏

（中國(guó)水稻研究所/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311400）

氣候變暖導(dǎo)致全球溫度升高是近年來(lái)氣候變化的明顯特征[1]，隨著全球氣溫升高，水稻高溫?zé)岷︻l發(fā)，尤其南方水稻在灌漿期遇到高溫已成為制約稻米品質(zhì)的重要因素。水稻灌漿結(jié)實(shí)期最適平均溫度為21℃左右，35℃以上高溫則會(huì)顯著降低稻米的產(chǎn)量和品質(zhì)[2-3]，籽粒碳氮代謝的生理過(guò)程對(duì)籽粒灌漿起著關(guān)鍵作用。作為籽粒干重的重要組分，淀粉和蛋白質(zhì)的代謝受碳氮代謝生理過(guò)程影響[4?5]。

高溫影響籽粒碳氮代謝，淀粉合成受阻及堊白含量顯著增加是高溫影響稻米品質(zhì)的顯著特征[6?7]。作為葉片光合產(chǎn)物向各器官運(yùn)輸?shù)闹饕问?，蔗糖是籽粒中淀粉合成的主要碳前體，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（SUTs）在通過(guò)質(zhì)外體途徑轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的過(guò)程中起重要作用[8?9]。高溫影響蔗糖代謝過(guò)程，Zhong等[10]研究指出，32℃以上高溫導(dǎo)致稻米食味和加工品質(zhì)下降與高溫抑制淀粉和蔗糖代謝存在關(guān)系，Zhang等的[11]研究指出，高溫通過(guò)破壞韌皮部胞間連絲而抑制蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)。陳燕華等[12]在穗發(fā)育的研究中指出，40℃高溫顯著降低蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，然而高溫對(duì)籽粒中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)的影響需進(jìn)一步研究。淀粉的進(jìn)一步合成依賴(lài)于ATP與各種酶促反應(yīng)的協(xié)調(diào)進(jìn)行，高溫降低淀粉合成關(guān)鍵酶（ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶及去分支酶活性）活性導(dǎo)致淀粉合成降低已成為基本共識(shí)[13?14]，而對(duì)籽粒中能量代謝與淀粉合成關(guān)系的研究相對(duì)較少。糖酵解和三羧酸循環(huán)是主要的產(chǎn)能途徑，α-酮戊二酸作為三羧酸循環(huán)重要的中間產(chǎn)物，也參與氮代謝中谷氨酸的合成，研究表明[15]，高溫抑制了穗發(fā)育過(guò)程中糖酵解和三羧酸循環(huán)過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性，而在籽粒中這種現(xiàn)象是否存在并不清楚。高溫促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成[16]，但高溫下氮代謝與三羧酸循環(huán)的關(guān)系并不清楚。轉(zhuǎn)錄組分析表明，灌漿期高溫影響表達(dá)的基因包括抑制蔗糖水解和淀粉合成，同時(shí)促進(jìn)淀粉水解和儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)合成[17?18]。然而蛋白質(zhì)和淀粉是否受到統(tǒng)一途徑代謝的影響并不清楚。為此，本研究擬以長(zhǎng)江中下游優(yōu)質(zhì)粳稻浙禾香2號(hào)為材料，選擇水稻種子發(fā)育5、10及15d這3個(gè)時(shí)期，在常溫和高溫處理下，通過(guò)籽粒發(fā)育過(guò)程中淀粉和蛋白積累的變化，分析蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)及分解、糖酵解及三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性、淀粉代謝關(guān)鍵酶活性以及氮代謝關(guān)鍵酶活性，以期深化籽粒灌漿期高溫?zé)岷碚?，明確高溫對(duì)碳氮代謝的影響，并為稻米品質(zhì)的調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)供試品種為嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的優(yōu)質(zhì)稻品種浙禾香2號(hào)，于2019年在中國(guó)水稻研究所富陽(yáng)試驗(yàn)基地進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，塑料種植盆規(guī)格為24cm×22.5cm×21.5cm，每盆裝過(guò)篩土8kg。5月25日播種，大棚基質(zhì)育秧，6月15日選取生長(zhǎng)狀況一致的秧苗進(jìn)行移栽，每盆2穴，每穴2苗，共120盆。每盆施復(fù)合肥（N∶P∶K=15%∶15%∶15%）4.0g作基肥，而后施0.5g尿素作分蘗肥，穗分化始期施2.25g復(fù)合肥作穗肥，水稻生長(zhǎng)期間其它管理措施與高產(chǎn)栽培一致。

1.2 溫度處理及籽粒樣本采集

設(shè)置適溫（NT）和高溫（HT）兩個(gè)處理，均在人工氣候箱（PGV-36型CONVIRON）內(nèi)進(jìn)行，具體溫度設(shè)置如表1。人工氣候箱具有自動(dòng)控溫控濕的功能，氣候箱透光面所用材質(zhì)為超透明的超白鋼化玻璃，具有低自爆率、顏色一致、可見(jiàn)光透過(guò)率高及通透性好等特點(diǎn)，其光照以外界自然光為主，光譜損失少，基本保持箱內(nèi)光照與外界自然光照一致，同時(shí)人工氣候箱底部有鼓風(fēng)裝置，以此保證二氧化碳濃度與室外基本一致。箱內(nèi)環(huán)境條件能達(dá)到試驗(yàn)處理要求。在水稻灌漿始期當(dāng)天正午移入氣候箱開(kāi)始進(jìn)行高溫和適溫處理，共持續(xù)15d，結(jié)束后移至自然環(huán)境下生長(zhǎng)至成熟，收獲時(shí)間為10月21日。

移入氣候箱后選擇大小基本一致的單穗掛牌標(biāo)記，每處理標(biāo)記80穗，供取樣分析。溫度處理期間，分別于5d（第6天）、10d（第11天）、15d（第16天）和成熟收獲時(shí)，各取稻穗20個(gè)，將穗子按長(zhǎng)度三等分，留取穗中部籽粒作為樣本，用鋁箔紙包裹，經(jīng)液氮冷凍后，裝入自封袋，置于?80℃冰箱保存，然后統(tǒng)一測(cè)定。

表1 人工氣候箱溫度設(shè)置Table 1 Temperature setting of different treatments in climate chamber

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1 粒重

在每次收集的籽粒樣本中，各取大小均勻的籽粒50顆去殼，置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A）中105℃殺青30min，80℃烘至恒重，后用德國(guó)sartoriys BS 224S電子天平測(cè)定粒重，算術(shù)平均計(jì)算單粒重。

1.3.2 蔗糖代謝關(guān)鍵酶活性及相關(guān)代謝物含量

在每次收集的籽粒樣本中，各取大小均勻的冷凍去殼籽粒0.1g檢測(cè)。蔗糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法[19]，葡萄糖和果糖含量、可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合酶活性利用蘇州某公司提供試劑盒進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 能量代謝關(guān)鍵酶活性及相關(guān)代謝物含量

在每次收集的籽粒樣本中，各取大小均勻的0.1g冷凍籽粒，利用己糖激酶、丙酮酸激酶、檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、琥玻酸脫氫酶及蘋(píng)果酸脫氫酶活性試劑盒進(jìn)行測(cè)定，利用ATP和ADP含量測(cè)定試劑盒進(jìn)行含量測(cè)定，試劑盒由蘇州某公司提供，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 淀粉代謝關(guān)鍵酶活性及相關(guān)代謝物含量

在每次收集的籽粒樣本中，各取大小均勻的0.1g冷凍籽粒。腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）含量采用雙抗體夾心法利用ELISA試劑盒測(cè)定，測(cè)定原理為，用純化的植物腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入植物腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG），再與HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合，形成抗體?抗原?酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中植物腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）含量。利用腺苷二磷酸葡萄萄糖焦磷酸化酶（AGP）、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶及淀粉磷酸化酶活性測(cè)定試劑盒（蘇州某公司提供）進(jìn)行測(cè)定。淀粉含量測(cè)定參考Hansen等[20]的方法。各指標(biāo)測(cè)定均3次重復(fù)，取平均值。

1.3.5 氮代謝關(guān)鍵酶活性及相關(guān)代謝物含量

全氮含量測(cè)定：在每次收集的籽粒樣本中，各取烘干后的籽粒0.2g，通過(guò)全自動(dòng)樣品快速研磨儀（Tissuelyser-48，上海）磨成細(xì)粉，采用H2SO4- H2O2消煮，并用FOSS全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定含氮量。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參考GB 5009.5-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法。

其它氮代謝相關(guān)指標(biāo)測(cè)定：選取0.1g冷凍籽粒。利用氨基酸含量、α-酮戊二酸含量、亞硝酸還原酶活性、硝酸還原酶活性、谷氨酰胺合成酶活性及谷氨酸合酶活性試劑盒進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)含量和活性的測(cè)定。各指標(biāo)測(cè)定均3次重復(fù)，取平均值。

1.3.6 籽粒RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量

取冷凍保存的籽粒樣品0.1g，用于蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因OsSUT1和OsSUT2相關(guān)表達(dá)量的測(cè)定。籽粒總RNA參照Trizol法[21]提取，利用TOYOBO的Rever Tra Ace quantitative PCR RT Master Mix（Toyobo， Osaka， Japan）試劑盒反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR所采用的設(shè)備為7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems System）。反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物稀釋后作為模板cDNA。用內(nèi)參基因OsUBQ引物檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，引物采用Primer5軟件設(shè)計(jì)，基因表達(dá)分析所用引物序列如表2所示；根據(jù)樣品特定熒光閾值的Ct值，采用2?ΔΔCt法[22]計(jì)算不同樣品間基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 2 Primers used for quantitative real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，用SAS9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，處理間的差異分析采用student單尾t檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫對(duì)籽粒重及其淀粉/蛋白質(zhì)含量的影響

圖1 灌漿初期高溫（HT）與適溫（NT）處理持續(xù)5d、10d和15d后采樣以及成熟時(shí)采樣觀(guān)測(cè)的籽粒重及其淀粉/蛋白質(zhì)含量的比較Fig.1 Comparison of grain weight and its starch/protein content sampled after 5d， 10d and 15d treatment， during the early stage of filling and maturity stage between high temperature（HT）and normal temperature（NT）

由圖1可知，高溫抑制水稻籽粒干物質(zhì)積累，但對(duì)淀粉和蛋白質(zhì)積累的影響存在差異。高溫處理15d導(dǎo)致成熟期籽粒粒重降低16.9%，處理期間高溫下淀粉相對(duì)含量降低，蛋白質(zhì)相對(duì)含量卻呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

2.2 高溫對(duì)籽粒碳代謝的影響

2.2.1 對(duì)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

蔗糖是籽粒中淀粉積累的重要來(lái)源，蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)與卸載對(duì)淀粉合成有重要意義，作為蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)家族的重要成員，OsSUT1和OsSUT2在籽粒灌漿過(guò)程中起著重要作用；葡萄糖和尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）是籽粒中淀粉合成的基礎(chǔ)物質(zhì)，其來(lái)源于光合產(chǎn)物蔗糖的分解。

由圖2可見(jiàn)，與適溫（31℃/24℃）條件下相比，灌漿初期高溫（35℃/28℃）持續(xù)5d、10d和15d后，籽粒中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsSUT1（圖2a）和OsSUT2（圖2b）的相對(duì)表達(dá)量均極顯著降低，而且高溫處理超過(guò)10d后，OsSUT2的相對(duì)表達(dá)量下降更多，從而造成高溫處理5d、10d和15d后籽粒中蔗糖含量極顯著低于同時(shí)段適溫條件下（圖2c）?？梢?jiàn)，灌漿初期高溫使籽粒發(fā)育過(guò)程中蔗糖供應(yīng)受到明顯抑制。

而由圖3可見(jiàn)，高溫條件下持續(xù)5d和10d處理中，籽粒中可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶活性（S-AI）（圖3a）和蔗糖合成酶（SS-I）活性（圖3b）極顯著高于適溫處理（P＜0.01），持續(xù)15d后該兩種酶的活性明顯下降，與適溫處理一致或明顯降低。SS-I主要催化蔗糖和UDP生成游離果糖和UDPG，而S-AI催化蔗糖不可逆地分解為葡萄糖和果糖，由圖3c、圖3d可見(jiàn)，高溫條件下持續(xù)5d和10d處理中籽粒中果糖含量明顯高于適溫處理，持續(xù)15d后果糖含量與適溫處理差異不顯著；而高溫條件下各處理時(shí)段籽粒中葡萄糖含量均明顯高于適溫處理?？梢?jiàn)，灌漿初期高溫使籽粒發(fā)育過(guò)程中S-AI和SS-I活性增加，加速了蔗糖向UDPG和葡萄糖的轉(zhuǎn)化。

2.2.2 對(duì)淀粉代謝的影響

蔗糖的分解產(chǎn)物在淀粉體中經(jīng)ADPG焦磷酸化酶（AGPase）催化形成淀粉的直接合成前體腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG），后經(jīng)顆粒結(jié)合淀粉合成酶（GBSS）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、淀粉分支酶（SBE）、淀粉去分支酶（DBE）等一系列酶的作用下分別合成直鏈淀粉和支鏈淀粉。

由圖4可見(jiàn)，隨著高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，AGPase活性降低，而ADPG含量卻呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，同時(shí)GBSS和SSS活性顯著下降，說(shuō)明直鏈淀粉合成受阻。同時(shí)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SBE活性先升高后降低，DBE活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。說(shuō)明灌漿前期15d高溫對(duì)淀粉合成的影響主要通過(guò)降低AGPase、GBSS、SSS和SBE的活性以及前10d的DBE的活性來(lái)降低淀粉的合成，高溫處理下ADPG含量上升的原因是其進(jìn)一步合成淀粉的途徑受阻。

圖2 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)量（a、b）和蔗糖含量（c）的比較Fig.2 Comparison of the expression of sucrose transporter genes（a，b） and sucrose content（c） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

圖3 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽?？扇苄运嵝赞D(zhuǎn)化酶活性（a）、蔗糖合成酶活性（b）、果糖含量（c）以及葡萄糖含量（d）的比較Fig.3 Comparison of soluble acid invertase activity（a）， sucrose synthase activity（b）， fructose content（c） and glucose content（d） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

圖4 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒AGPase（a）、GBSS（b）、SSS（c）、SBE（d）、DBE活性（e）及ADP-葡萄糖含量（f）的比較Fig.4 Comparison of the activity of AGPase（a）， GBSS（b）， SSS（c）， SBE（d）， DBE（e） and the ADPG（f） content in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

淀粉合成的同時(shí)也在不斷地被利用，α-淀粉酶、β-淀粉酶和淀粉磷酸化酶是主要的淀粉降解酶。由圖5可見(jiàn)，與適溫處理相比，隨著高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，ɑ-淀粉酶，β-淀粉酶及淀粉磷酸化酶活性呈上升的趨勢(shì)，說(shuō)明高溫促進(jìn)了籽粒淀粉水解。

可見(jiàn)，灌漿初期高溫使籽粒發(fā)育過(guò)程中淀粉合成減少，而淀粉的水解增強(qiáng)，最終導(dǎo)致淀粉含量的降低。

2.3 高溫對(duì)水稻籽粒糖酵解及三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

ATP參與ADPG和淀粉的合成，淀粉體中ATP的含量與ADPG和淀粉含量呈正相關(guān)[23]，糖酵解及三羧酸循環(huán)是主要的產(chǎn)能過(guò)程。對(duì)不同溫度處理下籽粒中糖酵解及三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶的分析可知，高溫下糖酵解關(guān)鍵酶活性受到抑制，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，己糖激酶和丙酮酸激酶活性顯著下降（圖6），說(shuō)明糖利用受阻。由圖7可見(jiàn)，三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性的變化在高溫下表現(xiàn)出明顯的差異，檸檬酸合酶、α-酮戊二酸脫氫酶及琥珀酸脫氫酶活性顯著下降，而隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，異檸檬酸脫氫酶和蘋(píng)果酸脫氫酶活性顯著升高。高溫下ATP和ADP總量與適溫下并無(wú)顯著差異。

可見(jiàn)，灌漿初期高溫致使能量代謝紊亂，最終導(dǎo)致高溫下ATP和ADP總量與適溫下并無(wú)顯著差異。

圖5 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒α-淀粉酶（a）、β-淀粉酶（b）以及淀粉磷酸化酶（c）活性的比較Fig.5 Comparison of the activity of α-amylase（a）， β-amylase（b） and starch phosphorylase（c） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

圖6 高溫（HT）與適溫（NT）處理己糖激酶活性（a）和丙酮酸激酶（b）活性的比較Fig.6 Comparison of the activity of hexokinase（a） and pyruvate kinaset（b） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

圖7 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性（a?e）及ATP和ADP含量總和（f）的比較Fig.7 Comparison of the activity of key enzymes in the tricarboxylic acid cycle（a-e），sum of ATP and ADP content（f） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

2.4 高溫對(duì)水稻籽粒氮代謝的影響

硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）是氮素同化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其活性顯著影響著蛋白質(zhì)含量。α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)過(guò)程的中間產(chǎn)物，也是氮代謝中形成谷氨酸的重要原料，谷氨酸則可轉(zhuǎn)化成其它氨基酸和酰胺進(jìn)而形成蛋白質(zhì)。

由圖8可見(jiàn)，隨著高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，籽粒總氮含量較常溫處理有上升趨勢(shì)，但差異未達(dá)顯著水平。α-酮戊二酸含量顯著增加，使谷氨酸的合成原料增加。同時(shí)谷氨酸和氨基酸含量在高溫處理下顯著提高。圖9顯示，與適溫處理相比，隨著高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，硝酸還原酶和亞硝酸還原酶活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，使谷氨酸的另一合成原料氨減少，而高溫下谷氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶活性與適溫相比差異不明顯。可見(jiàn)，灌漿初期高溫使籽粒發(fā)育過(guò)程中異檸檬酸脫氫酶活性增加和α-酮戊二酸活性的降低，加速了α-酮戊二酸的積累，促進(jìn)了α-酮戊二酸向谷氨酸的轉(zhuǎn)換，加速了籽粒中形成蛋白質(zhì)的原料即氨基酸含量的增加，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量升高。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)條件下，高溫抑制水稻籽粒發(fā)育，導(dǎo)致干物質(zhì)積累顯著下降。試驗(yàn)表明，隨著高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，淀粉含量顯著下降，而蛋白質(zhì)含量顯著上升，導(dǎo)致稻米品質(zhì)變差，這與前人的研究結(jié)論是一致的[24?25]。但高溫下淀粉和蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量低于適溫處理，說(shuō)明高溫對(duì)籽粒的物質(zhì)代謝造成影響。碳代謝方面，籽粒干物質(zhì)積累主要來(lái)源于光合作用的蔗糖供應(yīng)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高溫下蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)表達(dá)基因OsSUT1和OsSUT2表達(dá)量下調(diào)，說(shuō)明轉(zhuǎn)運(yùn)卸載到籽粒中的蔗糖受到抑制，Zhang等[11]研究表明，高溫下籽粒干物質(zhì)積累受阻的主要原因是蔗糖分解受阻，而在本研究中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，與適溫相比，可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶在高溫下呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，可見(jiàn)蔗糖分解受阻并不是干物質(zhì)積累降低的主要原因。與前人研究結(jié)果的差異可能是由于設(shè)置處理溫度不同導(dǎo)致，不同溫度條件下，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)和卸載對(duì)籽粒干物質(zhì)積累的影響程度有待進(jìn)一步明確。

圖8 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒全氮（a）、α-酮戊二酸（b）、谷氨酸（c）和氨基酸（d）含量的比較Fig.8 Comparison of the content of total nitrogen（a）， ɑ-Ketoglutarate（b）， glutamate（c）and amino acid（d） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT） treatments

圖9 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒硝酸還原酶（a）、亞硝酸還原酶（b）、谷氨酰胺合成酶（c）及谷氨酸合酶（d）活性的比較Fig.9 Comparison of the activities of nitrate reductase （a）， nitrite reductase （b）， glutamine synthetase （c） and glutamate synthase （d） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

高溫下葡萄糖和果糖含量有所上升，對(duì)糖酵解關(guān)鍵酶己糖激酶和丙酮酸激酶活性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)， 高溫下兩種酶活性均呈顯著下降趨勢(shì)，說(shuō)明糖利用受阻。另一方面，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高溫導(dǎo)致淀粉水解酶活性增加，這也是葡萄糖和果糖含量增加的原因之一，研究表明淀粉水解導(dǎo)致可溶性糖積累可以提高籽粒的抗氧化能力[26?27]。能量代謝方面，本實(shí)驗(yàn)中三羧酸循環(huán)過(guò)程關(guān)鍵酶活性在高溫下的變化不一致，可能是由反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致，作為三羧酸循環(huán)重要的中間產(chǎn)物，α-酮戊二酸的代謝與蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)，異檸檬酸脫氫酶活性上升促進(jìn)了α-酮戊二酸的合成，同時(shí)α-酮戊二酸脫氫酶活性受到抑制減少了α-酮戊二酸的利用，進(jìn)一步提高了α-酮戊二酸含量。雖然高溫導(dǎo)致三羧酸循環(huán)代謝紊亂，但ATP和ADP含量在高溫下并沒(méi)有發(fā)生顯著變化，說(shuō)明能量供應(yīng)并未受阻，α-酮戊二酸含量的增加也進(jìn)一步促進(jìn)氮代謝谷氨酸形成。氮代謝方面，高溫下氮代謝相關(guān)酶活性受高溫的影響較淀粉代謝相關(guān)酶活性受高溫的影響小，高溫下谷氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶活性受高溫影響不大，與梁成剛等[28]的結(jié)果有所差異，原因可能是不同遺傳背景材料的氮代謝過(guò)程對(duì)溫度的響應(yīng)不同。試驗(yàn)表明，α-酮戊二酸含量增加是蛋白質(zhì)相對(duì)量積累提高的原因之一。試驗(yàn)中，與適溫處理相比，高溫下氨基酸積累顯著增加，一方面與氨基酸合成增加有關(guān)，另一方面，可能由于高溫促進(jìn)了氨基酸向籽粒的轉(zhuǎn)運(yùn)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高溫下銨態(tài)氮和硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)量較低，更詳細(xì)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，高溫主要通過(guò)阻礙蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制籽粒發(fā)育，同時(shí)高溫導(dǎo)致糖酵解和三羧酸循環(huán)紊亂；高溫下籽粒淀粉含量下降的主要原因是淀粉合成受阻且淀粉水解增強(qiáng)；高溫會(huì)導(dǎo)致三羧酸循環(huán)過(guò)程紊亂，α-酮戊二酸積累增加是蛋白質(zhì)含量上升的原因之一。α-酮戊二酸參與的能量代謝的相關(guān)研究可為高溫下稻米品質(zhì)的改良提供新思路，α-酮戊二酸能否作為外源調(diào)節(jié)劑減弱灌漿前期高溫對(duì)水稻生產(chǎn)的影響，還有待進(jìn)一步研究。