食品中致敏蛋白的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

王世鵬

（黑龍江省標(biāo)檢產(chǎn)品檢測(cè)有限公司，黑龍江哈爾濱 150000）

食物過敏也稱為消化系統(tǒng)變態(tài)反應(yīng)或食物變態(tài)反應(yīng)等，是指利用所攝入食物的某種組成成分作為抗原，將其與機(jī)體中相應(yīng)抗體發(fā)生免疫應(yīng)答而產(chǎn)生的一種變態(tài)反應(yīng)疾病。如今，食物過敏已成為全球公共衛(wèi)生問題，是全球第六大疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球食物過敏案例明顯增加，英國(guó)有7%兒童食物過敏，澳大利亞有9%，而我國(guó)兒童食物過敏患病率高達(dá)6.2%，這比一般疾病的患病率要高很多。而在世界變態(tài)反應(yīng)組織報(bào)告中顯示，過敏現(xiàn)象困擾了全世界30%～40%的人口。此外，相關(guān)研究表明食物過敏能夠?qū)Σ煌娜巳寒a(chǎn)生相應(yīng)的負(fù)面影響，并且與焦慮癥的增加有緊密關(guān)系[1]，因此食物過敏嚴(yán)重影響人們的日常生活和身體健康。

為降低食物過敏的風(fēng)險(xiǎn)，保障消費(fèi)者的安全，歐盟、美國(guó)、加拿大、日本等多個(gè)國(guó)家已經(jīng)發(fā)布了相關(guān)條例，要求在食品標(biāo)簽中標(biāo)明食物的致敏原和含量[2]，我國(guó)發(fā)布GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》、GB/T 237792—2009《預(yù)包裝食品中的致敏原成分》等法規(guī)中也明確規(guī)定要在相應(yīng)的包裝標(biāo)簽上注明致敏物[3]，為消費(fèi)者提供一定的食用安全保障，即使能在一定程度上降低食物中毒的幾率，但依然存在很大的風(fēng)險(xiǎn)。此外，據(jù)調(diào)查結(jié)果表明食物中的主要致敏物質(zhì)是蛋白質(zhì)。因此，針對(duì)食物中的致敏蛋白能夠進(jìn)行準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)可以減少食物過敏現(xiàn)象，對(duì)于消費(fèi)者的健康提供了有效保護(hù)。對(duì)當(dāng)前食品中致敏蛋白的快速檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行調(diào)研也變得非常有意義。

1 食品中致敏蛋白概述

食品中主要的致敏原是蛋白質(zhì)，一般為相對(duì)分子質(zhì)量10～70 kD的蛋白質(zhì)或糖蛋白。根據(jù)引起的過敏反應(yīng)的臨床特點(diǎn)和速度不同，可以將過敏反應(yīng)分為4類：I型過敏反應(yīng)，即速發(fā)型過敏反應(yīng)；II型過敏反應(yīng)，又稱細(xì)胞毒性型過敏反應(yīng)；III型過敏反應(yīng)，即免疫復(fù)合物型過敏反應(yīng)；IV型過敏反應(yīng)，也就是遲發(fā)型過敏反應(yīng)。根據(jù)抗體種類的不同又可將介導(dǎo)分為2種類型：由抗體蛋白IgE介導(dǎo)型、由非抗體蛋白IgE介導(dǎo)型。其中，最常見的食物致敏反應(yīng)屬于IgE介導(dǎo)型[4]。IgE介導(dǎo)型的過敏機(jī)理是指過敏抗原通過機(jī)體的誘導(dǎo)進(jìn)入體內(nèi)，促進(jìn)體內(nèi)IgE的生成，繼而IgE結(jié)合到肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，使機(jī)體進(jìn)入對(duì)該過敏原特異致敏狀態(tài)，當(dāng)過敏原再次接觸時(shí)，與細(xì)胞膜上的IgE受體結(jié)合引起一系列生化反應(yīng)，繼而釋放出諸如組織胺等各種與過敏反應(yīng)和炎癥有關(guān)的生物活性介質(zhì)。由此可見，特異性IgE對(duì)于致敏蛋白的致敏作用有著很大的影響，兩者的結(jié)合是導(dǎo)致致敏蛋白發(fā)揮致敏性的主要環(huán)節(jié)。因此，通過檢測(cè)特異性的IgE表達(dá)量，能夠反映出致敏抗原的情況，從而對(duì)檢測(cè)致敏蛋白有著重要的指導(dǎo)意義。

2 食品中致敏蛋白的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

由于食物致敏作用對(duì)于人的健康有著嚴(yán)重的威脅，因此食品中致敏蛋白的檢測(cè)技術(shù)有著重要的研究?jī)r(jià)值和意義。當(dāng)前用于檢測(cè)致敏蛋白的技術(shù)根據(jù)檢測(cè)部位的不同分為體內(nèi)檢測(cè)和體外檢測(cè)2種。體內(nèi)檢測(cè)是利用動(dòng)物模型、人體皮膚或者雙盲安慰劑對(duì)照食物激發(fā)試驗(yàn)進(jìn)行定量或半定量地對(duì)食物致敏原的過敏活性進(jìn)行檢測(cè)，但具有一定的風(fēng)險(xiǎn)率，因此限制了檢測(cè)方法的應(yīng)用范圍[5]。體外檢測(cè)技術(shù)主要分為直接檢測(cè)致敏蛋白質(zhì)的方法和針對(duì)蛋白質(zhì)中基因檢測(cè)方法?；谥旅舻鞍椎臋z測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、電泳法、高效液相色譜與質(zhì)譜分析法等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是現(xiàn)在檢測(cè)致敏蛋白普遍使用的一種方法，其原理通過一種用酶標(biāo)記的抗體和相應(yīng)的致敏蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)，利用蛋白酶作為指示劑，使蛋白酶作用后底物的顯色深淺來反應(yīng)被測(cè)食品中抗原或抗體的含量，一般多采用雙抗體夾心法，即選用固相載體上的抗體將和相應(yīng)的致敏蛋白結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，然后將帶有酶標(biāo)記的另一種抗體和抗原抗體復(fù)合物相結(jié)合，使之發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色越深抗原吸附在固相載體的量越多[5]。雙抗體夾心ELISA法能夠提高測(cè)定的靈敏度、準(zhǔn)確性和檢測(cè)速度，此外還有間接法、競(jìng)爭(zhēng)法等。李曉燕等人[6]通過建立雙抗體ELISA法測(cè)定蝦中的致敏蛋白，得到了蝦中致敏蛋白的檢出最低限為40 ng/mL，在40～1 000 ng/mL的范圍內(nèi)線性良好。

2.2 電泳法

電泳法是指利用待測(cè)溶液中被測(cè)蛋白的質(zhì)量和所帶電荷的不同，在外加電場(chǎng)的作用下能夠在惰性介質(zhì)中形成狹窄的區(qū)帶，所形成的區(qū)帶在紫外光下能夠準(zhǔn)確測(cè)定分子量、等電點(diǎn)、純度等參數(shù)，從而能夠得到所測(cè)致敏蛋白的含量。電泳法主要有經(jīng)典電泳法、免疫親和毛細(xì)管電泳法、區(qū)帶毛細(xì)管電泳法以及凝膠毛細(xì)管電泳法等。經(jīng)典電泳法效率低、耗時(shí)長(zhǎng)、且商業(yè)化的試劑盒不夠成熟，因此經(jīng)典電泳法并不廣泛用于致敏蛋白的測(cè)定。田蘭等人[7]利用聚乙烯醇涂層毛細(xì)管，在紫外檢測(cè)214 nm，分離電壓20 kV條件下對(duì)乳及乳制品中的α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg） 等5種蛋白進(jìn)行分離測(cè)定。結(jié)果顯示，蛋白線性良好，測(cè)定的鮮奶中α-乳白蛋白（α-La） 含量為0.93 mg/mL，β-乳球蛋白 （β-Lg） 含量 2.67 mg/mL，α-酪蛋白 （α-CN） 14.32 mg/mL，β-酪蛋白 （β-CN） 4.12 mg/mL而k-酪蛋白（k-CN） 9.36 mg/mL。5種蛋白線性良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.997 8。

2.3 高效液相色譜與質(zhì)譜分析法

高效液相色譜與質(zhì)譜分析法（LC-MS/MS） 是將色譜的分離能力和質(zhì)譜的定性能力結(jié)合起來，能夠全面有效地對(duì)多種致敏蛋白進(jìn)行定量和定性分析，并且操作簡(jiǎn)便易行。洪宇偉等人[8]通過建立LCMS/MS定量檢測(cè)方法來測(cè)定烘培食品中花生過敏原Ara h2的含量，結(jié)果表明花生樣品中致敏蛋白Ara h2的定量限達(dá)4.45 μg/g，可回收率在106.0%～107.8%。李麗芳等人[9]在原有LC-MS/MS的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）檢測(cè)大豆中主要的致敏蛋白，最終成功篩選到可用于表征11種大豆主要過敏原（大豆球蛋白的G1、G2、G3、G4和G5亞基，β-伴大豆球蛋白的α"、α和β亞基，P34，P28及KTI）的特征肽段共29條，相較于原有的LC-MS/MS檢測(cè)分析法的，UPLC-MS/MS檢測(cè)目標(biāo)更廣泛，檢測(cè)結(jié)果能更全面、準(zhǔn)確的顯示出致敏蛋白的種類。

2.4 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法

實(shí)時(shí)性聚合酶鏈反應(yīng)是基于基因水平上對(duì)致敏蛋白進(jìn)行檢測(cè)的一種方式，即定量測(cè)定樣品中特定DNA序列的聚合酶鏈反應(yīng)。利用熒光實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)食品中Ara h1基因成分，從而推斷食品中是否含有花生過敏主要過敏原成分。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線在3×102～3×108copies的范圍內(nèi)線性良好，檢測(cè)低限設(shè)定為3×103copies。目前實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定技術(shù)可以對(duì)食品中的致敏蛋白進(jìn)行定量定性檢測(cè)，能夠針對(duì)特定食品中致敏蛋白的DNA進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，準(zhǔn)確性好。

3 結(jié)語

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和國(guó)際食品安全水平的提高，引起人們對(duì)于食物致敏等問題的高度重視，對(duì)于食品的安全性也有了更高的警惕性，因此保障食品安全，保證消費(fèi)者的食用健康是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)課題。建立食品中致敏蛋白的檢測(cè)技術(shù)，能夠較大程度的減少食物過敏情況的發(fā)生，具有重要的研究?jī)r(jià)值和意義。介紹了幾種主要的食品中致敏蛋白的檢測(cè)方法，但各類方法都存在相應(yīng)的限制性和缺陷，因此需要對(duì)當(dāng)前的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化和改善，從而提高食品的安全性。如今基因水平的檢測(cè)方法是食品檢測(cè)領(lǐng)域中的一個(gè)重要發(fā)展方向，能夠定量定性地檢測(cè)食品中的致敏蛋白成分。因此，將一些新型標(biāo)記材料運(yùn)用于基因水平的檢測(cè)技術(shù)，能夠提高檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性，對(duì)于食品中致敏蛋白的檢測(cè)具有深遠(yuǎn)意義。