基于iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合IPA生物信息分析探究大黃素鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制

陳 鵬，王 琛，張 杰，吳智兵，吳遠(yuǎn)華

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

神經(jīng)病理性疼痛是指軀體感覺(jué)系統(tǒng)損傷或疾病所引發(fā)的疼痛[1]。最新全球范圍內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，神經(jīng)病理性疼痛在普通人群中的患病率高達(dá)10%，其可出現(xiàn)在不同性質(zhì)的臨床疾病中，包括糖尿病、腦卒中、帶狀皰疹、多發(fā)性硬化、感染、癌癥、腰或頸神經(jīng)根型神經(jīng)病變、手術(shù)及創(chuàng)傷等[2,3]。神經(jīng)病理性疼痛的臨床表現(xiàn)主要包括自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏及異常性疼痛，且常伴有較為顯著的睡眠障礙、抑郁和焦慮等心理障礙，嚴(yán)重影響著患者的日常生活及行為功能，也給社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[4]。目前，神經(jīng)病理性疼痛的治療主要以抗癲癇、抗焦慮及阿片類藥物為主，但藥效有限，副作用明顯。因此，深入探討疼痛的發(fā)病機(jī)制，尋找并開(kāi)發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物已成為慢性疼痛研究的重要課題。

大黃素(1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌)是天然蒽醌類衍生物，分子式C15H10O5，為中藥大黃的主要活性成分。前期本課題組研究發(fā)現(xiàn)大黃素能夠顯著改善慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)模型實(shí)驗(yàn)大鼠自發(fā)性疼痛，提高痛覺(jué)閾值，緩解痛覺(jué)過(guò)敏，以50 mg·kg-1效果最佳。然而，關(guān)于大黃素具體鎮(zhèn)痛機(jī)制和作用靶點(diǎn)尚不清楚，有待于進(jìn)一步深入研究。

本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)同位素相對(duì)和絕對(duì)定量標(biāo)記技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation， iTRAQ)對(duì)大黃素干預(yù)下不同處理組實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓組織差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定和篩選，并結(jié)合創(chuàng)新途徑分析(ingenuity pathway analyses，IPA)對(duì)篩選差異表達(dá)蛋白進(jìn)行經(jīng)典通路分析、轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析、疾病與功能分析及相互作用網(wǎng)絡(luò)分析等，從而明確大黃素鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物30只SD大鼠，♂，7周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證編號(hào)：SCXK(粵)2013-0034]，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)所有操作程序符合廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物使用與倫理委員會(huì)審查。

1.2 藥物大黃素：購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，純度99.48%，規(guī)格1 g/瓶，批號(hào)MUST-16110712。

1.3 主要儀器Strata X C18脫鹽柱(美國(guó)Phenomenex公司)；E2695/2998高效液相色譜及XBridge Peptide BEH C18色譜柱(美國(guó)Waters公司)；Acclaim PepMap?100 C18上樣柱，Acclaim PepMap?RSLC C18分析柱，NanoLC 1 000 納升級(jí)高效液相及LTQ Orbitrap Elite 組合式質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥將30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組(Sham, S)、模型組(Model, M)及大黃素組(Emodin, E)。術(shù)后1 d開(kāi)始大黃素組給予大黃素混懸液，每日一次，連續(xù)15 d。

2.2 CCI模型制備麻醉，俯臥位固定，暴露坐骨神經(jīng)，4-0絲線做4道結(jié)扎，間隔1～2 mm，壓迫程度以神經(jīng)微塌陷為宜。假手術(shù)組僅暴露神經(jīng)但不結(jié)扎。

2.3 藥物制備大黃素溶液制備：將0.312 5 g大黃素溶解于50 mL 0.05% CMC-Na中制備成濃度為6.25 g·L-1大黃素混懸液。

2.4 樣品制備給藥后15 d，將大鼠深度麻醉，取術(shù)側(cè)脊髓組織，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)備用。

2.5 蛋白提取及濃度測(cè)定取脊髓組織樣品，加入適量細(xì)胞裂解液(8 mol·L-1尿素、2 mmol·L-1EDTA、10 mmol·L-1DTT、1%蛋白酶抑制劑混合液)，冰浴超聲破胞3次；4 ℃離心10 min后取上清液，加入預(yù)冷的TCA，-20 ℃沉淀2 h，4 ℃離心5 min，棄上清后，沉淀加入-20 ℃預(yù)冷的丙酮，洗滌3次去TCA，4 ℃離心5 min棄丙酮；加入復(fù)溶緩沖液(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1，pH 8.0)。參照試劑盒采用Bradford 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

2.6 iTRAQ標(biāo)記分別取50 μg樣品調(diào)整等體積，加入10 mmol·L-1DTT 37 ℃孵育60 min，再加入55 mmol·L-1IAM室溫孵育60 min；稀釋后按質(zhì)量比1 ∶50加入胰蛋白酶，37 ℃孵育過(guò)夜，再按質(zhì)量比1 ∶100加入胰蛋白酶37 ℃孵育4 h。Strata XC18脫鹽柱除鹽。運(yùn)用iTRAQ標(biāo)記試劑盒對(duì)各組樣品進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記信息為：假手術(shù)組-116、模型組-117及大黃素組-118。

2.7 肽段組分分離采用高pH C18色譜柱經(jīng)HPLC色譜儀分離樣品，流動(dòng)相A液為2%乙腈(pH 10),流動(dòng)相B液為98%乙腈(pH 10)。88 min線性梯度洗脫樣品，液相流速為0.7 mL·min-1,洗脫期間檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。共收集出的肽段流出組分，真空抽干后合并成12組分進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

2.8 肽段質(zhì)譜鑒定將12個(gè)組分溶于20 μL NanoLC A液，進(jìn)樣2 mL，經(jīng)Acclaim PepMap?100 C18上樣注后使用Acclaim PepMap?RSLC C18分析注梯度洗脫，流動(dòng)相A液為2%乙腈和0.1%甲酸，流動(dòng)相B液為98%乙腈和0.1%甲酸，液相流速為300 nL·min-1，時(shí)間為90 min。洗脫液進(jìn)入Orbitrap Elite質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜參數(shù)具體設(shè)置為：一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70 000，掃描范圍為350～1 500 m/z；二級(jí)質(zhì)譜分辨率為17 500，碰撞歸一化能量為30，采集標(biāo)準(zhǔn)為20個(gè)峰強(qiáng)度最高。

2.9 IPA分析使用Proteome Discoverer 1.3軟件將肽段鑒定的原始圖譜文件轉(zhuǎn)換為.mgf文件，通過(guò)MASCOT 2.3.0服務(wù)器進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索，以FDR<0.01標(biāo)準(zhǔn)，組間差異倍數(shù)≥±1.2且P<0.05的蛋白篩選為差異表達(dá)蛋白。將篩選的差異表達(dá)蛋白上傳至IPA生物信息分析平臺(tái)，進(jìn)行經(jīng)典通路分析、轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析、疾病與功能分析及相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

3 結(jié)果

3.1 大黃素對(duì)CCI大鼠脊髓組織蛋白表達(dá)的影響運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)共鑒定出不同處理組脊髓中差異表達(dá)蛋白177個(gè)，其中MvsS 篩選出表達(dá)蛋白102個(gè)，上調(diào)52個(gè)，下調(diào)50個(gè)；EvsM 篩選出差異表達(dá)蛋白109個(gè)，上調(diào)66個(gè)，下調(diào)43個(gè)，結(jié)果見(jiàn)Fig 1。

3.2 差異表達(dá)蛋白經(jīng)典通路分析Fig 2為假手術(shù)組、模型組及大黃素組脊髓組織差異表達(dá)蛋白在不同經(jīng)典通路中表達(dá)趨勢(shì)熱圖，結(jié)果顯示 EvsM 與 SvsM鑒定出的差異蛋白在不同經(jīng)典通路中趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明大黃素能夠反向調(diào)節(jié)CCI模型中異常激活或抑制的通路。為進(jìn)一步研究大黃素鎮(zhèn)痛作用所涉及的信號(hào)通路，我們對(duì)篩選的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行經(jīng)典通路分析。Fig 3顯示了 EvsM 差異表達(dá)蛋白所涉及的Top20經(jīng)典通路，其中預(yù)測(cè)激活的通路包括肝X受體/維甲酸X受體(liver X receptor/ retinoid X receptor，LXR/RXR)激活及巨噬細(xì)胞中一氧化氮和活性氧產(chǎn)生；預(yù)測(cè)顯著抑制的通路包括脊髓背角神經(jīng)元神經(jīng)病理性疼痛信號(hào)通路、促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GNRH)信號(hào)、突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、神經(jīng)元環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein， CREB)、突觸發(fā)生信號(hào)通路、阿片信號(hào)通路及鈣離子信號(hào)(z-score>2)。

Fig 1 Volcano plot of differently-expressed proteins in spinal cord

Fig 2 Heat map of classical pathways mediated by differently-expressed proteins

Fig 3 Top20 classical pathways mediated by differently-expressed proteins

Fig 4為詳細(xì)信號(hào)調(diào)控通路圖，進(jìn)一步深入分析各經(jīng)典通路上差異蛋白的表達(dá)趨勢(shì)及分子功能。其中以脊髓背角神經(jīng)元神經(jīng)病理性疼痛信號(hào)為例，與模型組相比，大黃素組實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓組織中原肌球蛋白相關(guān)激酶B(tropomyosin-related kinase B，TrkB)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(Ca/calmodulin-dependent protein kinases，CaMKⅡ)及蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)表達(dá)均下調(diào)，主要介導(dǎo)突觸后膜N-甲基-D天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)及α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR)等相關(guān)受體磷酸化及細(xì)胞核內(nèi)CREB信號(hào)通路激活。

3.3 差異表達(dá)蛋白上游調(diào)控因子上游調(diào)控因子分析主要預(yù)測(cè)差異表達(dá)蛋白的上游調(diào)控因子。如Tab 1所示，經(jīng)分析共預(yù)測(cè)出8個(gè)上游調(diào)控因子，包括TCF7L2、MLXIPL、APP、IFNG、TWIST1、Esrra、RICTOR及HMGA1。如Fig 5所示，上游調(diào)控因子與目標(biāo)分子間存在四種作用關(guān)系，分別為一致激活、一致抑制、結(jié)果與下游分子狀態(tài)不一致及無(wú)預(yù)測(cè)效果。例如，APP被預(yù)測(cè)為強(qiáng)烈激活，該基因存在C3、ALB、SUCLG、S100B、RPS6及GFAP在內(nèi)的6個(gè)一致激活的基因。RICTOR被預(yù)測(cè)為強(qiáng)烈抑制，該基因抑制導(dǎo)致下游基因PRKCB被抑制。

3.4 差異表達(dá)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)根據(jù)不同疾病與功能，進(jìn)一步深入分析 EvsM 差異表達(dá)蛋白間相互作用關(guān)系，并構(gòu)建IPA蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。如Tab 2所示，將Score >20分評(píng)定為可信，共構(gòu)建出5個(gè)確信度較高的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，分別是心血管疾病、代謝性疾病、機(jī)體損傷和異常，癌癥、細(xì)胞死亡和存活、RNA損傷和修復(fù)，細(xì)胞間信號(hào)與相互作用、藥物代謝、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能，細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞功能和維持、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，碳水化合物代謝、細(xì)胞損傷、小分子生物化學(xué)。其中與神經(jīng)病理性疼痛最為密切相關(guān)的是細(xì)胞間信號(hào)與相互作用、藥物代謝、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能。如Fig 6所示，該網(wǎng)路中包含6個(gè)上調(diào)蛋白，14個(gè)下調(diào)蛋白，這些蛋白共同參與了Akt、CREB及Actin等相關(guān)分子調(diào)節(jié)，其中CaMKⅡ、PKA及PP2A等蛋白與其他蛋白聯(lián)系最為密切。

Fig 4 Neuropathic pain signaling in dorsal horn neurons

Tab 1 Upstream regulators of differently-expressed proteins in E vs M

Tab 2 Protein interaction network of differently-expressed proteins

Fig 5 Figure of upstream regulators

4 討論

神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，仍缺乏統(tǒng)一認(rèn)識(shí)及廣泛有效的臨床藥物。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“不通則痛”是疼痛的主要發(fā)病機(jī)制，而氣滯血瘀是關(guān)鍵致病因素，行氣活血、以通治痛是急慢性疼痛治療的重要原則。大黃味苦，氣香而性涼，能入血分，破一切血瘀，具有活血化瘀的功效；同時(shí)可推陳致新，通暢氣機(jī)而安和五臟。故歷代醫(yī)家以大黃為主要藥物創(chuàng)立“升降散”、“大黃牡丹湯”、“下瘀湯”及“大黃附子湯”等名方，臨床上用于治療多種類型的急慢性疼痛。大黃素是中藥大黃的主要活性成分之一，本課題前期研究發(fā)現(xiàn)大黃素在神經(jīng)病理性疼痛CCI動(dòng)物模型中具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。脊髓背角是疼痛信息處理和傳遞的初級(jí)整合中樞，脊髓中樞敏化在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此本研究旨在運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出不同處理組差異表達(dá)蛋白并結(jié)合IPA生物通路分析，揭示大黃素鎮(zhèn)痛作用的脊髓機(jī)制。

Fig 6 Protein interaction network of differently-expressed proteins

經(jīng)IPA經(jīng)典通路分析，大黃素可顯著抑制脊髓背角神經(jīng)元神經(jīng)病理性疼痛信號(hào)通路、PKA信號(hào)通路、突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)通路、神經(jīng)元CREB信號(hào)通路及鈣離子信號(hào)通路等，從而抑制脊髓中樞敏化及突觸異常傳遞，緩解神經(jīng)病理性疼痛。進(jìn)一步深入分析各經(jīng)典通路上差異蛋白的表達(dá)趨勢(shì)及分子功能，我們推測(cè)大黃素可下調(diào)PKC、CaMKⅡ及PKA等相關(guān)蛋白激酶表達(dá)，影響NMDA受體、AMPA受體及CREB核轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，降低興奮性突觸后電流，抑制疼痛相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。此外，經(jīng)IPA分析發(fā)現(xiàn)，大黃素亦可介導(dǎo)LXR/RXR通路激活，抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路，從而降低IL-1β等在內(nèi)的炎癥介質(zhì)表達(dá)水平，發(fā)揮抗神經(jīng)病理性疼痛作用[5-7]。

隨后，本研究進(jìn)一步運(yùn)用IPA上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析預(yù)測(cè)大黃素干預(yù)下脊髓組織中差異表達(dá)蛋白上游調(diào)控因子，其中與大黃素鎮(zhèn)痛作用相關(guān)的潛在因子主要為TCF7L2及APP。TCF7L2又稱為T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子4(T cell factor 4，TCF4)，是T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)子結(jié)合因子(T cell factor/lymphocyte enhancer factor，TCF/LEF)家族成員，在Wnt信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。最新研究表明，TCF7L2通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞分化、成熟，促進(jìn)髓鞘形成和再生[9-11]。本研究亦發(fā)現(xiàn)大黃素組脊髓組織中髓鞘堿性蛋白、髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白及髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白等髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)升高。淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)是神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布的Ⅰ型跨膜蛋白，其由分泌酶剪切后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可溶性淀粉樣前體蛋白α(soluble APP alpha，sAPPα)能夠抑制神經(jīng)元興奮性，改善突觸傳遞，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12]。研究表明，APP及其代謝產(chǎn)物能夠抑制實(shí)驗(yàn)小鼠痛覺(jué)過(guò)敏和炎癥性疼痛[13]。

最后，我們進(jìn)一步分析了EvsM 差異表達(dá)蛋白間相互作用關(guān)系，并構(gòu)建了IPA蛋白互作網(wǎng)路，其中與大黃素鎮(zhèn)痛作用最為相關(guān)的是細(xì)胞間信號(hào)與相互作用、藥物代謝、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能。在該網(wǎng)路中鑒定出Akt、CREB及粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)等關(guān)鍵基因。Akt又稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB),是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其激活后可進(jìn)一步磷酸化下游靶蛋白如NF-κB, 從而調(diào)控多種細(xì)胞活動(dòng)和生物功能，并參與神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生[14-15]。CREB作為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的核因子，廣泛表達(dá)于神經(jīng)元中，其可被PKA、CaMKⅡ等多種蛋白激酶激活，調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性[16]。FAK是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶，其與整合素配體結(jié)合后磷酸化激活，參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及突觸可塑性[17]。研究表明，F(xiàn)AK可通過(guò)抑制細(xì)胞膜鈣ATP酶影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，介導(dǎo)傷害性反應(yīng)[18]。

本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)聯(lián)合IPA生物信息分析揭示了大黃素可能通過(guò)抑制脊髓背角神經(jīng)元神經(jīng)病理性疼痛、突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、神經(jīng)元CREB、突觸發(fā)生信號(hào)及鈣離子信號(hào)等發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。同時(shí)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TCF7L2及APP是大黃素干預(yù)下差異表達(dá)蛋白可能的上游調(diào)控分子。最后，我們發(fā)現(xiàn)大黃素通過(guò)干預(yù)CaMKⅡ、PKA及PP2A等差異蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)“細(xì)胞間信號(hào)與相互作用、藥物代謝、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能”互作網(wǎng)路，發(fā)揮抗神經(jīng)病理性疼痛作用。