miR-29a-3p和miR-144a-3p下調(diào)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞COL11A1表達(dá)并抑制其增殖、遷移和侵襲

趙田甜，左 瑋，淦 鑫

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江西 南昌 330006)

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)性死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤[1]。據(jù)最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，肺癌的5年生存率僅為15.7%～17.4%[2]。在所有肺癌患者發(fā)病人數(shù)中，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)最為常見(jiàn)，占所有肺癌總發(fā)病數(shù)的85%[2]。與小細(xì)胞肺癌相比，雖然NSCLC的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，但NSCLC確診時(shí)，大多數(shù)患者已處于中晚期[3]。目前，小分子酪氨酸激酶抑制劑和免疫治療劑雖然給NSCLC患者帶來(lái)了的生存益處，但NSCLC的5年生存率仍然很低[3-4]。因此，迫切需要繼續(xù)尋找NSCLC治療的策略。

Ⅺ型膠原α1(collagen type XI alpha 1，COL11A1)屬于膠原蛋白家族成員之一，是間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。有研究表明，COL11A1在胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和復(fù)發(fā)性肺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且其異常高表達(dá)與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[5-8]。但COL11A1在這些腫瘤中具體的生物學(xué)功能卻不明確。因此，本研究目的之一是探討COL11A1在NSCLC中的關(guān)鍵作用。

眾所周知，microRNAs (miRNAs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。眾多miRNAs可作為胃癌、肝癌、甲狀腺癌和膀胱癌等多種腫瘤的診斷和治療的標(biāo)志物[9-12]。因此，對(duì)NSCLC中miRNAs的鑒定和篩選有助于識(shí)別NSCLC新的診斷或治療性生物標(biāo)志物。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)COL11A1在NSCLC組織和細(xì)胞中明顯上調(diào)。COL11A1的下調(diào)抑制了NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。目前，COL11A1表達(dá)與miRNA調(diào)節(jié)在NSCLC進(jìn)展中的內(nèi)部聯(lián)系尚不清楚。因此，我們嘗試通過(guò)targetScan 7.2軟件尋找與COL11A1存在潛在靶向關(guān)系的miRNAs，鑒定它們?cè)贜SCLC中與COL11A1的內(nèi)在聯(lián)系，并試圖分析miRNAs/COL11A1軸在NSCLC發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用，為其在NSCLC治療中的提供潛在的應(yīng)用策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 COL11A1 siRNA、陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA，NC-siRNA)、COL11A1抗體、Ki67抗體和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)抗體購(gòu)自Santa Cruz；EdU試劑盒、CCK-8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、β-actin抗體和二抗購(gòu)自上海碧云天公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIzol試劑和Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自Invitrogen；TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green qPCR試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems；miR-29a-3p模擬物(miR-29a-3p mimic)、miR-144a-3p mimic、let-7a-5p mimic、miR-26a-5p mimic和陰性對(duì)照miRNA(negative control miRNA，NC-miR)由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

1.1.2NSCLC組織收集 本研究納入2018年9月～2019年6月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科和腫瘤科行腫瘤切除術(shù)的20例NSCLC患者(臨床Ⅱ～Ⅲ期，其中6例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，14例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，并收集腫瘤組織與配對(duì)的癌旁非腫瘤組織(距離腫瘤邊緣約2 cm)。NSCLC患者均為首次確診，且術(shù)前未進(jìn)行放化療。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有患者均知情同意參與本研究。

1.1.3細(xì)胞 人肺癌細(xì)胞A549、H460、H520和H1299為本實(shí)驗(yàn)室自有；肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和16-HBE購(gòu)自上海一研生物科技有限公司。

1.1.4儀器 小型垂直蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))；iBright CL750型蛋白凝膠智能成像系統(tǒng)(Invitrogen公司，美國(guó))；BX53M型金相顯微鏡(Olympus公司，日本)；QuantStudio 7 Flex型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems公司，美國(guó))；FLx800型熒光酶標(biāo)儀(BioTek公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) A549、H460、H520、H1299、BEAS-2B和16-HBE細(xì)胞均接種在添加有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集H520對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于直徑35 mm培養(yǎng)皿中，按照轉(zhuǎn)染試劑制造商的說(shuō)明書步驟，利用Lipofectamine 2000試劑將COL11A1 siRNA(10 nmol·L-1)、NC-siRNA(10 nmol·L-1)、miR-29a-3p mimic(20 nmol·L-1)、miR-144a-3p mimic(20 nmol·L-1)、let-7a-5p mimic(20 nmol·L-1)、miR-26a-5p mimic(20 nmol·L-1)和NC-miR(20 nmol·L-1)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3RNA提取與RT-qPCR檢測(cè) 按照制造商說(shuō)明書步驟，運(yùn)用TRIzol試劑提取NSCLC組織、癌旁非腫瘤組織、NSCLC細(xì)胞系和正常細(xì)胞系BEAS-2B和16-HBE中總RNA，利用TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒將各樣本總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，以各樣本cDNA和各目的基因引物并利用SYBR Green qPCR試劑盒通過(guò)7500熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。miR-29-3p、miR-144-3p、let-7-5p和miR-26-5p以U6為內(nèi)部參照，COL11A1以GAPDH為內(nèi)部參照，以2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。qPCR運(yùn)用的引物序列(5′-3′): miR-29a-3p (正向):GCGGCGG TAGCACCATCTGAAAT，miR-29a-3p (反向):ATCC AGTGCAGGGTCCGAGG；miR-144a-3p (正向): GCG CGCTACAGTATAGATGATG，miR-144a-3p(反向): GCTGTCAACGATACGCTACG；let-7a-5p(正向): CG ATTCAGTGAGGTAGTAGGTTGT，let-7a-5p(反向): TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC；miR-26a-5p(正向): ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAATCCAGGA，miR-26a-5p(反向): TGGTGTCGTGGAGTCG；U6(正向): GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，U6(反向): GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG；COL11A1(正向): TGGTGATCAGAATCAGAAGTTCG，COL11A1(反向): AGGAGAGTTGAGAATTGGGAATC；GAPDH(正向): GTGGACATCCGCAAAGAC，GAPDH(反向): AAAGGGTGTAACGCAACTA。

1.2.4細(xì)胞活性和增殖檢測(cè) 用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，按照說(shuō)明書步驟，將已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種植在96孔中(4 000細(xì)胞/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，加入10 μL CCK-8溶液并繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。用EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖，按照說(shuō)明書步驟，將已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種植在96孔中(4 000細(xì)胞/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，加入10 μmol·L-1EdU溶液并繼續(xù)孵育45 min，4%多聚甲醛固定15 min，0.3%Triton-100透膜5 min，內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶封閉液封閉15 min，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入50 μL Click反應(yīng)液避光孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入20 μL Streptavidin-HRP工作液孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入100 μL TMB顯色液孵育10 min，用酶標(biāo)儀在650 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。

1.2.5Transwell檢測(cè) 用Transwell(濾膜8 μm孔徑，24孔板)法檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲。100 μL已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸液(5 000細(xì)胞/孔)加入Transwell上室濾膜上表面用于檢測(cè)細(xì)胞遷移，加入Transwell上室基質(zhì)膠包被的濾膜上表面用于檢測(cè)細(xì)胞侵襲；下室加入600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2下孵育24 h。取出腔室并擦除濾膜上表面細(xì)胞，95%甲醇固定濾膜下表面細(xì)胞，用0.5%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.6Western blot檢測(cè) 用RIPA裂解組織和細(xì)胞，并提取蛋白。用BCA試劑盒對(duì)蛋白定量，每樣本取等量蛋白，按照常規(guī)Western blot步驟進(jìn)行操作。其中按照1 ∶1 000比例孵育一抗(COL11A1、Ki67和MMP-2)，并采用ImageJ軟件，以β-actin為內(nèi)部參照量化COL11A1、Ki67和MMP-2的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將人COL11A1野生型(wild type，WT)和突變型(mutation type，MUT)3′-UTR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并克隆到pGL3-熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中。用Lipofectamine 2000試劑將pGL3-COL11A1-3′UTR WT質(zhì)粒+NC-miR、pGL3-COL11A1-3′UTR WT質(zhì)粒+miR-29a-3p mimic、pGL3-COL11A1-3′UTR MUT質(zhì)粒+NC-miR、pGL3-COL11A1-3′UTR MUT質(zhì)粒+miR-29a-3p mimic或pGL3-COL11A1-3′UTR WT質(zhì)粒+NC-miR、pGL3-COL11A1-3′UTR WT質(zhì)粒+miR-144a-3p mimic、pGL3-COL11A1-3′UTR MUT質(zhì)粒+NC-miR、pGL3-COL11A1-3′UTR MUT質(zhì)粒+miR-144a-3p mimic共轉(zhuǎn)染入H520細(xì)胞中，48 h后，按照制造商說(shuō)明書步驟，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定螢火蟲和海腎熒光素酶相對(duì)發(fā)光度(relative light unit，RLU)。報(bào)告基因熒光活性=螢火蟲熒光素酶RLU/海腎熒光素酶RLU。

2 結(jié)果

2.1 COL11A1在NSCLC組織和細(xì)胞中表達(dá)增高相對(duì)于癌旁組織，在NSCLC腫瘤組織中COL11A1的mRNA水平(Fig 1A)和蛋白水平(Fig 1B、C)明顯增加(P<0.01)；且相對(duì)于非轉(zhuǎn)移的NSCLC的腫瘤組織，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC腫瘤組織中COL11A1的mRNA水平(Fig 1D)和蛋白水平(Fig 1E、F)也明顯增加(P<0.01)。在細(xì)胞學(xué)中，相對(duì)于正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B和16-HBE，在NSCLC細(xì)胞系H460、H520、A549和H1299中COL11A1的mRNA水平(Fig 1G)和蛋白水平(Fig 1H、I)也明顯增加(P<0.01)。

2.2 敲低COL11A1抑制H520細(xì)胞增殖、遷移與侵襲通過(guò)轉(zhuǎn)染COL11A1 siRNA用于敲低H520細(xì)胞中COL11A1的表達(dá)(Fig 2A、B)，發(fā)現(xiàn)敲低COL11A1明顯抑制Ki67表達(dá)(Fig 2C、D)、細(xì)胞活性(Fig 2E)、細(xì)胞增殖(Fig 2F)、MMP-2表達(dá)(Fig 2G、H)、細(xì)胞遷移(Fig 2I、J)和侵襲(Fig 2I、K)(P<0.05或P<0.01)。

2.3 與COL11A1具有靶向關(guān)系的miRNAs的尋找與驗(yàn)證TargetScan 7.2軟件預(yù)測(cè)有4個(gè)miRNAs(miR-29a-3p、miR-144a-3p、let-7a-5p、miR-26a-5p)與COL11A1的3-UTR區(qū)域具有潛在的結(jié)合序列，因此，本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)此4個(gè)miRNAs在NSCLC組織中的表達(dá)，結(jié)果(Fig 3A)顯示，與癌旁組織比較，在NSCLC腫瘤組織中此4個(gè)miRNAs表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)。在H520細(xì)胞上檢測(cè)miR-29a-3p(Fig 3B)和miR-144a-3p(Fig 3C)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與BEAS-2B和16-HBE比較，在H520細(xì)胞中miR-29a-3p和miR-144a-3p表達(dá)水平也明顯降低(P<0.01)。進(jìn)一步對(duì)H520轉(zhuǎn)染4個(gè)miRNAs的mimic(Fig 3D、E)，發(fā)現(xiàn)與NC-miR比較，在H520細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-29a-3p mimic和miR-144a-3p mimic能明顯抑制COL11A1表達(dá)(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染let-7a-5p mimic或miR-26a-5p mimic對(duì)COL11A1表達(dá)無(wú)影響，提示miR-29a-3p和miR-144a-3p可能與COL11A1具有靶向關(guān)系，而let-7a-5p和miR-26a-5p與COL11A1不具有靶向關(guān)系。為驗(yàn)證miR-29a-3p或miR-144a-3p與COL11A1是否具有靶向關(guān)系，對(duì)預(yù)測(cè)的miR-29a-3p(Fig 3F)或miR-144a-3p(Fig 3H)的靶向結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，雙熒光素酶證實(shí)COL11A1是miR-29a-3p(Fig 3G)或miR-144a-3p(Fig 3I)的靶基因。

Fig 1 Over-expression of COL11A1 in NSCLC tumor tissues and cells

2.4 過(guò)表達(dá)miR-29a-3p或miR-144a-3p抑制H520細(xì)胞增殖、遷移與侵襲通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-29a-3p mimic或miR-144a-3p mimic顯著H520細(xì)胞的細(xì)胞活性(Fig 4A)、細(xì)胞增殖(Fig 4B)、抑制Ki67表達(dá)(Fig 4C、D)、MMP-2表達(dá)(Fig 4E、F)、細(xì)胞遷移(Fig 3G、H)和侵襲(Fig 3G、I)(P<0.05或P<0.01)。

3 討論

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率均占據(jù)所有腫瘤的首位[13]。NSCLC約占所有肺癌的85%，且NSCLC起病隱匿、早期病癥不明顯、容易被忽視，造成約75%的NSCLC患者確診時(shí)已處于中晚期[2]。因此，研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，明確NSCLC的基因靶點(diǎn)，對(duì)NSCLC的診斷和治療具有重要意義。最近的研究顯示，COL11A1可以調(diào)節(jié)卵巢癌、結(jié)腸癌和胃癌等多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖、凋亡、化療敏感性、侵襲和遷移，其在多種腫瘤中發(fā)揮致癌和促癌的特性[5-6,14-15]。且已有研究發(fā)現(xiàn)，COL11A1可能是NSCLC有價(jià)值的診斷標(biāo)志物，其可參與調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞增殖、化療敏感性、遷移與侵襲[8,16]。但在NSCLC中調(diào)節(jié)COL11A1表達(dá)改變的上游分子仍不明確，有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)首先確認(rèn)了COL11A1在NSCLC腫瘤組織和NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，敲除COL11A1表達(dá)能抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移與遷移，這與之前的研究一致[12]。

眾所周知，miRNAs可通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)功能[10-11]。TargetScan7.2預(yù)測(cè)軟件顯示有4種miRNAs(miR-29a-3p、miR-144a-3p、let-7a-5p和miR-26a-5p)與COL11A1的3’-UTR區(qū)可能具有潛在結(jié)合序列。因此，本研究通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和miRNAs mimic轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)與COL11A1可能具有靶向關(guān)系miRNAs進(jìn)行了篩選與確認(rèn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NSCLC細(xì)胞中miR-29a-3p和miR-144a-3p與COL11A1具有靶向關(guān)系，且miR-29a-3p和miR-144a-3p可負(fù)調(diào)控靶基因COL11A1表達(dá)。已有研究表明，此2種miRNAs在甲狀腺癌、肝癌和膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中可作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[10-11,17]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，miR-29a-3p和miR-144a-3p在NSCLC腫瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)，且過(guò)表達(dá)miR-29a-3p和miR-144a-3p能發(fā)揮與COL11A1敲低類似的生物學(xué)作用。這些結(jié)果表明，miR-29a-3p和miR-144a-3p能通過(guò)下調(diào)靶基因COL11A1表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。

Fig 2 Proliferation，migration and invasion of H520 cells inhibited by knockdown of COL11A1

總之，我們的研究表明，miR-29a-3p和miR-144a-3p可能在NSCLC進(jìn)展中作為一種潛在的腫瘤抑制因子。此外，miR-29a-3p和miR-144a-3p通過(guò)直接靶向COL11A1抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。

Fig 3 Search and validation of miRNAs with a targeted relationship with COL11A1

Fig 4 Proliferation，migration and invasion of H520 cells