含笑內(nèi)酯衍生物ACT001對(duì)肺纖維化的治療作用研究

李咪咪，漢京霞，孫 濤,2，劉慧娟,2

(天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院 1.分析測(cè)試中心，2.早期成藥性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

肺纖維化是由多種病因引起的嚴(yán)重肺間質(zhì)慢性疾病。發(fā)病機(jī)制迄今尚未闡明，缺乏特異性治療[1]手段。二甲基胺含笑內(nèi)酯富馬酸鹽(DMAMCL，命名為ACT001)是由倍半萜內(nèi)酯類(lèi)化合物小白菊內(nèi)酯經(jīng)化學(xué)合成而來(lái)[2]，具有在水中易溶、原料易得、制備工藝成熟簡(jiǎn)單、成藥性好的特性，目前其作為腦膠質(zhì)瘤治療藥物的臨床試驗(yàn)已經(jīng)在開(kāi)展。研究表明，ACT001可通過(guò)作用于IκB激酶β(inhibitor kappa B kinaseβ，IKKβ)蛋白，中等強(qiáng)度地抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，同時(shí)提高癌細(xì)胞中的活性氧簇水平，兩者均可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[3-5]。在肺纖維化過(guò)程中，NF-κB可通過(guò)促進(jìn)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-8和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄而介導(dǎo)肺泡炎和肺纖維化[6]的發(fā)生發(fā)展；肺纖維化小鼠用抗TGF-β1[7]抗體治療后，發(fā)現(xiàn)血清中細(xì)胞因子IL-4、IL-6水平明顯下降，組織羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量也減少，肺纖維化被明顯抑制，同時(shí)，TGF-β是上皮細(xì)胞在發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)分子之一。有研究發(fā)現(xiàn)[8]，ACT001可降低類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠淋巴結(jié)中NF-κB相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-17等炎癥因子的表達(dá)水平；也有研究顯示，ACT001可以通過(guò)降低炎癥因子TNF-α的表達(dá)而對(duì)銀屑病具有治療作用?；谝陨涎芯勘尘?，我們推測(cè)，ACT001可能通過(guò)抑制NF-κB的活化、抑制EMT過(guò)程并且調(diào)節(jié)肺纖維化相關(guān)炎癥因子的表達(dá)等發(fā)揮治療肺纖維化的作用。

1 材料

1.1 試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青/鏈霉素購(gòu)自Gibco 公司；NIH-3T3(小鼠成纖維細(xì)胞系)購(gòu)自美國(guó)ATCC；MTT購(gòu)自上海生工生物；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司；地塞米松磷酸鈉、硫酸博來(lái)霉素(bleomycin, BLM)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；百草枯(paraquat, PQ)購(gòu)自百靈威科技有限公司；羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IFN-γ、TGF-β1 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；ACT001由南開(kāi)大學(xué)陳悅教授提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系為SPF級(jí)昆明健康小鼠體質(zhì)量(18～22) g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：0039483。

2 方法

2.1 小鼠肺纖維化模型的建立及給藥治療本研究共建立兩種小鼠肺纖維化模型，誘導(dǎo)劑分別為百草枯(PQ)和博來(lái)霉素(BLM)。每種小鼠肺纖維化模型中，隨機(jī)將60只小鼠分為2組，空白組10只，建模組50只。由PQ誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，建模組小鼠在建模前，提前禁食16 h，灌胃給予劑量為100 mg·kg-1，空白組用同體積的生理鹽水灌胃；由BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，建模組小鼠經(jīng)氣管灌注給予BLM水溶液(5 mg·kg-1)，空白組用同樣方式灌注同體積的生理鹽水，建模當(dāng)天記為d 1。

d 7將建模組的50只小鼠隨機(jī)分為5組，分別為：模型組10只、陽(yáng)性藥地塞米松組10只、ACT001組(設(shè)置高、中、低3個(gè)劑量組，每組10只)，♀♂各半。d 8小鼠給藥治療(給藥前稱(chēng)重)，ACT001高(ACT001-H)、中(ACT001-M)、低(ACT001-L)劑量組每次分別按50、25、12.5 mg·kg-1劑量灌胃給藥治療；陽(yáng)性藥地塞米松(dexamethasone，DEX)組，按0.45 mg·kg-1劑量灌胃給藥治療，空白組及模型組小鼠按體重灌胃給予相應(yīng)體積的生理鹽水，給藥時(shí)間為28 d。自給藥之日起，每天測(cè)定各組小鼠體重，觀察并記錄小鼠的一般生活狀態(tài)。d 39(給藥結(jié)束d 2)將各組小鼠稱(chēng)重，然后進(jìn)行摘眼球取血置于含肝素鈉的EP管中，4 ℃離心機(jī)離心，4 000×g，15 min，取上清用于測(cè)定血漿中的TNF-α、IFN-γ、TGF-β1含量。取血后脊椎脫臼處死小鼠，取小鼠肺組織稱(chēng)重，并計(jì)算肺系數(shù)：肺系數(shù)=肺濕重(g)·體質(zhì)量(kg)-1。取左肺凍存于-80 ℃冰箱中，用于進(jìn)行膠原百分含量的測(cè)定；將右肺組織經(jīng)10%福爾馬林固定。

2.2 肺組織HYP及肺組織膠原百分含量測(cè)定精確稱(chēng)取肺組織濕重，放入離心管，準(zhǔn)確加入水解液，混勻。加蓋后95 °C水或沸水水解20 min，水解10 min 混勻1次，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)具體操作，檢測(cè)肺組織HYP含量[9]。HYP百分含量/%=(樣品吸光度÷標(biāo)準(zhǔn)液吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度×稀釋倍數(shù)×樣品體積÷肺組織干粉重量×100%；膠原百分含量/%=HYP百分含量(%)×7.46。

2.3 組織病理學(xué)評(píng)估肺組織肺纖維化程度將固定后的各組小鼠肺組織用流水沖洗，常規(guī)脫水、制作石蠟組織切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色及Masson染色，在顯微鏡下觀察肺組織的形態(tài)學(xué)變化以及膠原纖維含量的變化。

2.4 免疫組化石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后，放入檸檬酸緩沖液中進(jìn)行高溫修復(fù)，蒸餾水沖洗，10%山羊血清濕盒內(nèi)封閉20 min,后滴加一系列的一抗，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，PBS沖洗，滴加稀釋的二抗(1 ∶1 000)，室溫避光孵育1 h，PBS沖洗，滴加DAB顯色。蘇木精染核1～2 min，脫水至二甲苯，最后，將中性樹(shù)膠滴在玻片組織區(qū)后蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察拍照。免疫組化圖片的評(píng)分方法：染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)染色:0；淺棕黃色：+；棕黃色：++；棕褐色：+++。染色面積所占比率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1%～25%，1；25%～50%，2；50%～75%，3；>75%，4。總分=顏色深度評(píng)分×染色面積所占比率評(píng)分。

3 結(jié)果

3.1 ACT001對(duì)PQ誘導(dǎo)的肺纖維化模型的治療作用

3.1.1小鼠生活狀態(tài)觀察和體質(zhì)量變化 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)各組小鼠的一般生活狀態(tài)進(jìn)行臨床觀察：空白組小鼠，反應(yīng)靈敏，皮毛發(fā)亮、有光澤，呼吸平穩(wěn)；與空白組小鼠相比，模型組小鼠精神萎靡，皮毛雜亂、無(wú)光澤，呼吸急促，體形較消瘦；ACT001各劑量組及地塞米松組小鼠精神、食欲、皮毛色澤、體重及活動(dòng)情況較模型組均有所改善。同時(shí)，小鼠體重檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥2周后，陽(yáng)性藥地塞米松組及ACT001各劑量組的體重增長(zhǎng)情況均好于模型組。給藥結(jié)束后，與空白組相比，模型組小鼠的體重明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，ACT001高、中、低劑量組及地塞米松組的小鼠體重明顯升高(P<0.01)。ACT001-高劑量組的體重改善情況好于地塞米松組(Fig 1A)。

3.1.2ACT001對(duì)PQ誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠肺系數(shù)與HYP百分含量的影響 在肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中，肺系數(shù)與肺組織HYP百分含量有明顯變化：與空白組相比，模型組小鼠肺系數(shù)明顯升高(P<0.01)，由此可見(jiàn)，模型的建立是成功的；與模型組相比，ACT001-高劑量組、ACT001-中劑量組、ACT001-低劑量組及陽(yáng)性藥地塞米松組小鼠肺系數(shù)均明顯減小(P<0.01)；與陽(yáng)性藥地塞米松組相比，ACT001-高劑量組小鼠肺系數(shù)低于陽(yáng)性藥地塞米松組(Fig 1B)。

小鼠肺組織HYP百分含量與膠原百分含量結(jié)果顯示：與空白組相比，模型組小鼠肺組織HYP百分含量與膠原百分含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，ACT001-高劑量組、ACT001-中劑量組、ACT001-低劑量組及陽(yáng)性藥地塞米松組小鼠的肺組織HYP百分含量及膠原百分含量均明顯降低(P<0.01)；與陽(yáng)性藥地塞米松組相比，ACT001-高劑量組小鼠肺組織HYP百分含量及膠原百分含量均低于陽(yáng)性藥地塞米松組(Fig 1C,D)。

3.1.3ACT001對(duì)PQ誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠肺組織病理變化的影響 HE染色(Fig 2A)及組織病理學(xué)評(píng)分(Fig 2B)結(jié)果顯示：空白組肺內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，未出現(xiàn)水腫、炎癥及纖維化特征，肺泡腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有明顯滲出物。與空白組比較，模型組肺組織結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺泡腔明顯縮小，膠原纖維和成纖維細(xì)胞大量增多，替代了肺間質(zhì)，可見(jiàn)明顯的肺間質(zhì)纖維化，組織病理學(xué)評(píng)分明顯升高(P<0.01)；地塞米松組肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域較模型組有所減少，肺泡炎感性程度和肺纖維化程度較模型組有所降低，但仍有較多的纖維組織增生，肺泡腔的縮小程度有所改善。與模型組相比較，ACT001各劑量組小鼠的肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域明顯減少，肺組織結(jié)構(gòu)較模型組也更為完整，成纖維細(xì)胞增殖減輕，肺泡炎性程度和肺纖維化程度較模型組有不同程度的降低，組織病理學(xué)評(píng)分均明顯降低(P<0.01)，其中，ACT001-高劑量組效果最明顯。由此可見(jiàn)，ACT001可以劑量依賴(lài)性的改善PQ誘導(dǎo)的肺纖維化程度。

Fig 1 Effect of ACT001 on body weight, lung confficient, content of hydroxyproline and collagen in PQ-induced PF mice n=10)

Masson染色結(jié)果顯示(Fig 2 C,D)，空白組小鼠肺組織支氣管壁的膠原層較薄，肺泡區(qū)分布有少量纖細(xì)的膠原；模型組小鼠肺組織支氣管壁、肺間質(zhì)和肺泡隔中膠原纖維明顯增多，小血管壁及其周?chē)?，膠原分布較空白組多，支氣管周?chē)z原增生，并延伸向肺間質(zhì)、在間質(zhì)沉積，肺組織局部充血水腫、可見(jiàn)明顯的紅細(xì)胞聚集，組織病理學(xué)評(píng)分明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組可見(jiàn)肺間質(zhì)中支氣管壁、血管壁和肺泡隔的膠原染色程度較模型組有所減輕；ACT001各劑量組肺間質(zhì)中支氣管壁、血管壁和肺泡隔的膠原染色及肺組織局部充血水腫現(xiàn)象均較模型組有不同程度的減輕。其中，ACT001-高劑量組效果最明顯(P<0.01)。

3.1.4ACT001對(duì)PQ誘導(dǎo)的肺纖維化模型炎癥因子的影響 利用ELISA試劑盒檢測(cè)ACT001對(duì)血漿中肺纖維化相關(guān)炎癥因子的影響，結(jié)果顯示：與空白組相比，模型組的TGF-β1及TNF-α含量均升高(P<0.01)；IFN-γ含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，ACT001-高劑量組TGF-β1及TNF-α的含量明顯降低(P<0.01)，IFN-γ水平明顯升高(Fig 3)。

3.2 ACT001對(duì)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型的治療作用

3.2.1小鼠生活狀態(tài)觀察和體重變化 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)各組小鼠的一般生活狀態(tài)進(jìn)行觀察：空白組小鼠反應(yīng)靈敏，皮毛光澤、發(fā)亮、呼吸平穩(wěn)，體重逐漸增加；模型組小鼠精神不振、活動(dòng)減少、皮毛枯槁、無(wú)光澤、呼吸急促、體形消瘦；ACT001各劑量組及地塞米松組小鼠精神、食欲、皮毛色澤、體重及活動(dòng)情況較模型組均明顯改善。同時(shí)，小鼠體重檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥后陽(yáng)性藥組及ACT001組的體重增長(zhǎng)情況好于模型組。給藥結(jié)束后，與空白組相比，模型組小鼠的體重明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，ACT001-高、中、低劑量組及地塞米松組對(duì)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠的體重降低均有明顯改善(P<0.01)(Fig 4A)。

Fig 2 Effect of ACT001 on histopathological changes in PQ-induced PF mice n=10)

Fig 3 Effect of ACT001 on content of inflammatory factors in PQ-induced PF mice n=10)

3.2.2ACT001對(duì)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠肺系數(shù)與HYP百分含量的影響 肺系數(shù)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示(Fig 4B)：與空白組相比，模型組小鼠肺系數(shù)明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，ACT001-高劑量組、ACT001-中劑量組、ACT001-低劑量組及陽(yáng)性藥地塞米松組小鼠肺系數(shù)均明顯減小(P<0.01)；與陽(yáng)性藥地塞米松組相比，ACT001-高劑量組小鼠肺系數(shù)低于陽(yáng)性藥地塞米松組，具有明顯差異(P<0.01)。

小鼠肺組織羥脯氨酸百分含量與膠原百分含量檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白組相比，模型組小鼠肺組織羥脯氨酸百分含量與膠原百分含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，ACT001-高劑量組、ACT001-中劑量組及陽(yáng)性藥地塞米松組小鼠的肺組織羥脯氨酸百分含量及膠原百分含量均明顯降低(P<0.01)；與陽(yáng)性藥地塞米松組相比，ACT001-高劑量組小鼠肺組織羥脯氨酸百分含量及膠原百分含量明顯降低(Fig 4 C，D)。

Fig 4 Effect of ACT001 on body weight, lung coefficient, content of hydroxyproline and content of collagen in BLM-induced PF mice n=10)

Fig 5 Effect of ACT001 on histopathological changes in BLM-induced PF mice n=10)

3.2.3ACT001對(duì)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠肺組織病理變化的影響 HE染色(Fig 5A)及病理學(xué)評(píng)分(Fig 5B)結(jié)果顯示：空白組肺組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，沒(méi)有水腫、炎癥及纖維化特征。與空白組比較，模型組肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺泡腔縮小，膠原纖維和成纖維細(xì)胞大量增多，可見(jiàn)明顯的肺間質(zhì)纖維化，組織纖維化程度病理學(xué)評(píng)分明顯升高(P<0.01)；地塞米松組肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域較模型組有所減少，肺泡炎性程度和肺纖維化程度較模型組有所降低，但仍有較多的纖維組織增生。與模型組比較，ACT001各劑量組小鼠的肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域明顯減少，肺組織結(jié)構(gòu)較模型組也更為完整，成纖維細(xì)胞增殖程度減輕，肺泡炎程度和肺纖維化程度較模型組有不同程度的降低，其中，ACT001-高劑量組及ACT001-中劑量組的組織病理學(xué)評(píng)分降低明顯(P<0.01)。以上結(jié)果表明，ACT001可以明顯改善BLM誘導(dǎo)的肺纖維化程度。

Masson染色結(jié)果顯示(Fig 5 C,D)，空白組小鼠肺組織支氣管壁的膠原層較薄，肺泡區(qū)僅有少量纖細(xì)的膠原；模型組小鼠肺組織支氣管壁、肺間質(zhì)和肺泡隔中膠原纖維明顯增多，小血管壁及其周?chē)z原分布較空白組多，支氣管周?chē)z原增生，并延伸向肺間質(zhì)、在間質(zhì)沉積，肺組織局部充血水腫、可見(jiàn)明顯的紅細(xì)胞聚集，組織病理學(xué)評(píng)分明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組可見(jiàn)肺間質(zhì)中支氣管壁、血管壁和肺泡隔的膠原染色較模型組有所減輕；ACT001各劑量組肺間質(zhì)中支氣管壁、血管壁和肺泡隔的膠原染色及肺組織局部充血水腫現(xiàn)象均較模型組有不同程度的減輕。其中，ACT001-高劑量組效果最明顯(P<0.01)。

3.2.4ACT001對(duì)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型炎癥因子的影響 利用ELISA試劑盒檢測(cè)ACT001對(duì)血漿中肺纖維化相關(guān)炎癥因子的影響，結(jié)果顯示(Fig 6)：與空白組相比，模型組的TGF-β1及TNF-α含量均升高(P<0.01)；IFN-γ含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，ACT001-高劑量組TGF-β1及TNF-α的含量明顯降低(P<0.01)，IFN-γ水平明顯升高(P<0.01)。

3.3 ACT001抑制肺纖維化模型小鼠EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)本研究分析了ACT001對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中EMT相關(guān)蛋白的影響(Fig 7)。對(duì)IHC結(jié)果進(jìn)行分析，ACT001增加了上皮細(xì)胞標(biāo)志物，E-cad的表達(dá)，并降低了間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)；同時(shí)，ACT001促進(jìn)了細(xì)胞因子MMP2的表達(dá)水平。與模型組相比，ACT001可以抑制肺纖維化小鼠肺組織NF-κB的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。這些結(jié)果顯示，ACT001可以抑制NF-κB的表達(dá)，并且抑制肺上皮細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

Fig 6 Effect of ACT001 on content of inflammatory factors in BLM-induced PF mice n=10)

4 討論

肺纖維化的主要特征為彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，最終可導(dǎo)致肺間質(zhì)的纖維化，是導(dǎo)致呼吸衰竭的主要病理基礎(chǔ)，是一種難治愈、死亡率高的肺間質(zhì)疾病。在肺纖維化模型中，百草枯和博來(lái)霉素是目前應(yīng)用較多的兩種肺纖維化模型的誘導(dǎo)劑。百草枯為聯(lián)吡啶類(lèi)化合物，是一種除草劑。研究顯示，百草枯中毒后，肺臟是其主要靶器官。中毒5～9 d后，可見(jiàn)繼發(fā)性損傷致肺纖維化。因而，由百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化，以發(fā)病最快、最典型而被大多研究采用。目前，百草枯誘導(dǎo)肺纖維化，其發(fā)病機(jī)理仍不清楚。有研究稱(chēng)，百草枯被吸收后，機(jī)體受刺激而產(chǎn)生大量氧自由基，引起器官、組織、細(xì)胞的脂質(zhì)氧化；也有研究稱(chēng)，肺泡細(xì)胞可主動(dòng)攝取和蓄積百草枯，而導(dǎo)致嚴(yán)重的肺臟受損，最終導(dǎo)致肺纖維化。博來(lái)霉素提取自輪生鏈霉菌，是一種抗腫瘤藥物。有研究發(fā)現(xiàn)，博來(lái)霉素被肺泡吸收后，可影響炎癥因子的表達(dá)，誘發(fā)肺纖維化的發(fā)生。目前，由博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的動(dòng)物模型也已被普遍應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)ACT001對(duì)上述兩種模型都有一定的治療效果。表明ACT001可能對(duì)肺纖維化過(guò)程中的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程和炎癥因子的產(chǎn)生都有一定的阻斷作用。

大量間質(zhì)細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的積聚和增殖，是肺纖維化的主要病理特點(diǎn)，多項(xiàng)研究表明，這些細(xì)胞是由上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)樣轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)化而來(lái)[10-11]。Milara等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在肺腺癌A549細(xì)胞中，還是在特發(fā)性肺纖維化患者中，都存在EMT過(guò)程，伴隨上皮細(xì)胞標(biāo)志物、E-鈣黏蛋白的下調(diào)及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-肌動(dòng)蛋白、纖連蛋白的上調(diào)。TGF-β是EMT發(fā)生的主要調(diào)節(jié)分子之一，其通過(guò)Smad依賴(lài)性的HEY1基因來(lái)激活細(xì)胞的EMT過(guò)程[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化中肌成纖維細(xì)胞活化與TGF-β1/ERK/Smad3通路相關(guān)[14]。肺纖維化小鼠用抗TGF-β1抗體治療后，體內(nèi)血清細(xì)胞因子IL-4、IL-6水平均明顯下降，組織羥脯氨酸(HYP)含量也減少，肺纖維化被明顯抑制。本研究結(jié)果提示，ACT001可降低肺纖維化模型小鼠的TGF-β1水平，促進(jìn)E-cad的表達(dá)，抑制Vimentin的表達(dá)，從而抑制EMT進(jìn)程，發(fā)揮治療肺纖維化的作用。

NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在肺纖維化過(guò)程中，NF-κB 可通過(guò)促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-8和TGF-β1等的基因轉(zhuǎn)錄而介導(dǎo)肺泡炎和肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展[15]。研究表明，牛磺酸、尼克酸、活化蛋白C等均可以通過(guò)抑制NF-κB的活化減少纖維細(xì)胞膠原的合成，減輕肺纖維化的程度[6,16]。Tong等[17]在硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的炎癥性腸病動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ACT001可通過(guò)抑制NF-κB的激活，降低炎性腸病的癥狀，降低炎癥導(dǎo)致的腫瘤發(fā)生幾率；王振華等[8]研究中發(fā)現(xiàn)，ACT001能降低類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠的淋巴結(jié)中與NF-κB相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-17等的表達(dá)水平。本研究顯示，ACT001可明顯抑制細(xì)胞核內(nèi)的p65的表達(dá)水平，并且隨著ACT001濃度的升高，這種抑制作用也隨之加強(qiáng)。ACT001也可降低肺纖維化模型小鼠的TNF-α、IL-4、TGF-β1水平，表明ACT001可以通過(guò)抑制NF-κB的活化來(lái)抑制TNF-α、IL-4、TGF-β1的表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮治療肺纖維化的作用。

綜上所述，ACT001可以通過(guò)抑制NF-κB的活性，抑制TNF-α、IL-4、TGF-β1等肺纖維化過(guò)程中關(guān)鍵炎癥因子的分泌并上調(diào)IFN-γ因子，從而抑制支氣管上皮、肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞等間充質(zhì)細(xì)胞，抑制成纖維細(xì)胞的增殖、遷移及膠原合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝，從而發(fā)揮抑制肺纖維化的作用。此外，ACT001具有良好的安全性，已被作為治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的孤兒藥物[18]，正在進(jìn)行多項(xiàng)臨床試驗(yàn)(ACTRN12616000228482，澳大利亞和新西蘭；ChiCTR-OIC-17013604，中國(guó))，有望開(kāi)發(fā)為治療肺纖維化的新藥。

Fig 7 Influenced of ACT001 on expression of EMT-related proteins in BLM-induced PF mice n=10)