組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶NSD3在腫瘤發(fā)生中的作用*

張瑾 李艷 潘云

NSD3［nuclear receptor suppressor of variegation，enhancer of zeste，and trithorax（SET）domain-contain?ing 3］是組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（histone lysine methyltransferase，HKMTases）NSD（nuclear receptorbinding SET Domain）家族成員中的一員，該家族由NSD1、NSD2（MMSET/WHSC1）和NSD3（又稱Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1-like 1，WHSC1L1）組成。NSD3 可識(shí)別并甲基化組蛋白賴氨酸殘基，以調(diào)節(jié)染色質(zhì)的完整性和基因的表達(dá)，越來越多的研究證實(shí)了NSD3 基因的擴(kuò)增或與其他基因的融合等與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，本文對(duì)NSD3在多種腫瘤中的研究作一綜述，綜合闡述NSD3結(jié)構(gòu)特征及其在腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制。

1 NSD3蛋白的結(jié)構(gòu)與特征

NSD3于2001年因蛋白質(zhì)C端有700個(gè)氨基酸與NSD1、NSD2 相同，而被發(fā)現(xiàn)。其基因位于8p11.23上，迄今為止，已證實(shí)了NSD3 通過不同的剪切方式可衍生出3 種異構(gòu)蛋白：長（long，L）、短（short，S）和WHISTLE蛋白（圖1）［1-2］。除了NSD3S外均具有SET結(jié)構(gòu)域、PWWP 結(jié)構(gòu)域（proline-tryptophan-trypto?phan-proline，脯氨酸-色氨酸-色氨酸-脯氨酸）、PHD鋅指結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain）。NSD3L 特有的C端富含半胱氨酸-組氨酸（cys-his-rich domain，C5HCH）結(jié)構(gòu)［3-5］。NSD3L、NSD3S 在大腦、心臟和骨骼肌中高表達(dá)［2］，是人類重要的致癌基因，過表達(dá)能將健康細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞［6］。WHISTLE 主要在人睪丸和急性淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)，有報(bào)道顯示其可以抑制基因轉(zhuǎn)錄［7］。

SET結(jié)構(gòu)域可細(xì)分為前SET結(jié)構(gòu)域，核心SET結(jié)構(gòu)域、后置SET 結(jié)構(gòu)域，其利用輔因子S-腺苷-L-甲硫氨酸介導(dǎo)NSD 家族蛋白的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，是NSD3 發(fā)揮催化作用的功能基團(tuán)。NSD3 C 末端（Cterminal domain，CTD）的SET結(jié)構(gòu)域可以在核小體上甲基化組蛋白H3 賴氨酸K36 殘基；后置SET 結(jié)構(gòu)域中的TKKKTR 序列是與核小體的結(jié)合位點(diǎn)，以核小體為底物催化組蛋白H3 賴氨酸K36 二甲基化（his?tone H3 lysine K36 dimethylation，H3K36me2）［8-9］。

圖1 組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶NSD3結(jié)構(gòu)圖

PWWP結(jié)構(gòu)域通過在核小體水平識(shí)別DNA和組蛋白賴氨酸的甲基化來充當(dāng)染色質(zhì)修飾的解讀器［6，10］。PWWP結(jié)構(gòu)域具有雙重功能，既能與DNA結(jié)合，又能與甲基化的組蛋白賴氨酸結(jié)合。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域直接與H3K36 三甲基化（trimethyl?ation，me3）結(jié)合，而與H3K36me2 的結(jié)合較弱［11］。在酒釀酵母中過表達(dá)人NSD3S的PWWP結(jié)構(gòu)域可誘導(dǎo)腫瘤代謝表型的獲得，導(dǎo)致精氨酸水平顯著下降，出現(xiàn)癌癥中常見的代謝變化，首次建立了人類癌蛋白NSD3S和癌癥代謝重編程之間的功能聯(lián)系［12］。

PHD 鋅指結(jié)構(gòu)域，是一種可識(shí)別組蛋白甲基化的結(jié)構(gòu)域［13］。在酵母菌中發(fā)現(xiàn)不同蛋白的PHD結(jié)構(gòu)域可以分別識(shí)別H3K4me3或H3K36me3［14］。對(duì)NSD3的PHD5晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)域選擇性結(jié)合未甲基化的H3K4和H3K9me3［15］。

2 NSD3在多種腫瘤中表達(dá)異常

組蛋白甲基化在染色質(zhì)重塑和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。NSD3的擴(kuò)增或與其他基因融合等一直是許多腫瘤發(fā)生的重要特征，是重要的致癌基因（表1）。以下對(duì)NSD3與腫瘤之間的關(guān)系以及致瘤機(jī)制分別闡述。

表1 與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶NSD3相關(guān)的腫瘤

2.1 NSD3與乳腺癌

約15%的原發(fā)性人類乳腺癌樣本中發(fā)現(xiàn)了8p11-12 區(qū)域 的 擴(kuò)增，F(xiàn)GFR1、LSM-1、C8orf4（TC-1）、RAB11FIP1、NSD3和ERLIN2是擴(kuò)增區(qū)域中的候選癌基因，研究發(fā)現(xiàn)NSD3是所有8p11-12區(qū)癌基因中轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)的。該區(qū)域癌基因的擴(kuò)增與組織學(xué)分級(jí)和不良預(yù)后相關(guān)，同時(shí)免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC）顯示在原發(fā)性乳腺癌中NSD3 蛋白水平呈高表達(dá)［16-17］。將NSD3的基因通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A后，可使細(xì)胞在沒有生長因子的情況下持續(xù)生長并形成擴(kuò)張集落，過度表達(dá)NSD3的MCF10A細(xì)胞可形成明顯異常的腺泡；相反，敲除NSD3基因可減慢細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞死亡［17］。在8p11-12擴(kuò)增的原發(fā)性乳腺癌標(biāo)本中，基因組分析顯示編碼NSD3L的CTD片段（包括SET結(jié)構(gòu)域）的基因區(qū)域出現(xiàn)缺失，而編碼NSD3S的外顯子1～10出現(xiàn)擴(kuò)增［17］。NSD3可以上調(diào)IRX3（Iroquois homeobox 3）、下調(diào)TGFB1（trans?forming growth factor-beta 1）等目的基因的表達(dá)，從而可能通過活化WNT信號(hào)通路（Wnt/β-cantenin），促進(jìn)腫瘤的形成［17］。

乳腺癌病毒啟動(dòng)子調(diào)控的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)NSD3在乳腺上皮組織中高表達(dá)，導(dǎo)致導(dǎo)管上皮非典型增生，并最終形成原位癌和浸潤性導(dǎo)管癌［32］。

2.2 NSD3與AML

在t（8；11）（p11；p15）易位的急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者中，發(fā)現(xiàn)核孔蛋白-98（nucleoporin 98 kDa，NUP98）-NSD3 融合轉(zhuǎn)錄本［18］，同時(shí)在1例放射性相關(guān)骨髓增生異常綜合征的原子彈幸存患者中，也發(fā)現(xiàn)了上述融合伴隨del（1）（p22p32）缺失［19］。對(duì)該融合轉(zhuǎn)錄本的mRNA 進(jìn)行分析顯示，NUP98 的1～11 外顯子與NSD3 的第4 個(gè)以及之后的外顯子形成的框內(nèi)融合轉(zhuǎn)錄本，可以形成NUP98-NSD3L和NUP98-NSD3S融合蛋白［19］，具有該融合的AML預(yù)后差且易復(fù)發(fā)。

NSD3也可以與其他蛋白相互作用形成致癌復(fù)合物。在AML中，NSD3S可作為適配蛋白與含溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）和染色域-解旋酶-DNA結(jié)合蛋白8（chromodomain-helicase-DNAbinding protein 8，CHD8）結(jié)合，形成BRD4-NSD3S-CHD8相互作用，NSD3S在沒有SET結(jié)構(gòu)域的情況下，可以允許轉(zhuǎn)錄激活，是維持AML增殖的重要亞型，敲除NSD3基因可抑制人AML細(xì)胞系HL-60、MOLM-13［20，33］。

2.3 NSD3與NMC

堅(jiān)果中線癌（NUT midline carcinoma，NMC）又稱NUT carcinoma（NC）是一種帶有NUT 融合基因的非常罕見且分化差的鱗狀細(xì)胞癌。研究發(fā)現(xiàn)在141 例NMC 病例中NUT 融合基因比例分別為BRD4-NUT 78%，BRD3-NUT 15%，NSD3-NUT 6%，前者預(yù)后最差，后兩者腫瘤轉(zhuǎn)移率低于前者［21］。NSD3-NUT融合基因，由t（8；15）（p12；q15）易位形成，是NSD3外顯子1～7 與NUT 外顯子2～7 融合而形成的框內(nèi)轉(zhuǎn)錄本。NUT 抗體免疫印跡驗(yàn)證了NSD3-NUT 融合癌蛋白的表達(dá)，該融合蛋白保留了N 端區(qū)PWWP 結(jié)構(gòu)域但沒有SET 結(jié)構(gòu)域［22］，該融合的第1～569 個(gè)氨基酸序列與NSD3S 相似，也間接表明NSD3S 在不具備甲基轉(zhuǎn)移酶活性的情況下可以獨(dú)立促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［22］。敲低NSD3-NUT使帶有該融合基因的NMC細(xì)胞系1221 細(xì)胞系增殖減緩，分化增強(qiáng)［22］。BRD4/3-NUT 融合是由t（15；19）（q14；p13.1）易位引起的，該融合蛋白在轉(zhuǎn)錄因子參與下與RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RNA pol Ⅱ）結(jié)合，驅(qū)動(dòng)致癌基因的表達(dá)以阻斷腫瘤分化并推動(dòng)腫瘤生長［34］。研究發(fā)現(xiàn)在BRD4-NUT 細(xì)胞系中敲低NSD3，或在NSD3-NUT 細(xì)胞系中敲低BRD4均可使相應(yīng)細(xì)胞系增殖減緩，分化增強(qiáng)，說明BRD4可以與NSD3結(jié)合［22］。

2.4 NSD3與肺癌

使用組織芯片對(duì)肺癌組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)NSD3在癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的非癌組織［23］。The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫挖掘與分析研究發(fā)現(xiàn)NSD3 在21%的肺鱗癌中擴(kuò)增，NSD3 擴(kuò)增的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1581（7 個(gè)拷貝NSD3）和H1703（6個(gè)拷貝NSD3）中發(fā)現(xiàn)NSD3的mRNA和蛋白質(zhì)水平在這些細(xì)胞系中呈高表達(dá)，其蛋白水平與NSD3 拷貝數(shù)呈正相關(guān)［16］。研究發(fā)現(xiàn)NSD3 SiRNA 沉默，降低了腫瘤細(xì)胞中H3K36me2 水平，從而影響了有絲分裂過程中的細(xì)胞周期蛋白G1（Cyclin G1）和NIMA 相關(guān)激酶7（NIMA related kinase 7，NEK7）的表達(dá)，使細(xì)胞停滯在G2～M期，G1期的癌細(xì)胞比例明顯降低［23］。在腫瘤相關(guān)蛋白與蛋白相互作用分析實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在肺癌H1299 細(xì)胞系中，NSD3S 與MYC 結(jié)合，并且與BRD4形成BRD4-NSD3S-MYC相互作用，從而增加MYC 蛋白的穩(wěn)定性以及MYC 癌蛋白目的基因的轉(zhuǎn)錄活性［24］。

2.5 NSD3與其他腫瘤

在膀胱癌和肝癌中，IHC證實(shí)NSD3高表達(dá)，敲低NSD3基因，可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，降低了Cyclin G1期和NEK7的表達(dá)水平，使細(xì)胞停滯在G2～M期，G1 期的癌細(xì)胞比例明顯降低［23］。隨后在骨肉瘤中，發(fā)現(xiàn)NSD3可能參與G2～M期檢查點(diǎn)的調(diào)節(jié)，抑制骨肉瘤細(xì)胞中的NSD3，會(huì)使處于G2～M期的細(xì)胞比例和凋亡細(xì)胞數(shù)量增加［25］。

NSD3 基因在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma of the head and neck，SCCHN）中出現(xiàn)擴(kuò)增，并導(dǎo)致H3K36me2水平升高，通過上調(diào)與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變，加速細(xì)胞增殖。NSD3擴(kuò)增與該病的不良分級(jí)和重度吸煙史呈正相關(guān)［26］。該研究小組隨后發(fā)現(xiàn)NSD3 可以單甲基化表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的賴氨酸K721，激活下游的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase ERK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增強(qiáng)其與增殖細(xì)胞核抗原（proliferat?ing cell nuclear antigen，PCNA）的相互作用，加速DNA復(fù)制，加快SCCHN細(xì)胞的周期進(jìn)展［27］。

在結(jié)直腸癌中，對(duì)NSD 家族基因變異情況的研究發(fā)現(xiàn)，NSD3的基因擴(kuò)增率最高，并且與其mRNA表達(dá)高度相關(guān)，符合腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的特點(diǎn)［28］。大腸癌中，NSD3過表達(dá)通過激活ERK1/2信號(hào)通路和增加肌動(dòng)蛋白加帽蛋白（actin-capping protein CAPG）表達(dá)，刺激大腸癌細(xì)胞增殖、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epi?thelial-mesenchymal transition，EMT）能力［29］。

TCGA 在輸卵管、卵巢、子宮內(nèi)膜來源的高級(jí)別漿液性癌的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)存在NSD3-BRD4-CHD8 通路擴(kuò)增，相比于無此通路擴(kuò)增的腫瘤，預(yù)后更差，整體生存率更低［30］。TCGA 對(duì)399 例前列腺癌樣本的51個(gè)HKMTases數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)雄激素受體高表達(dá)的癌組織中NSD3、SETD2、KMT2B、NSD1等出現(xiàn)明顯擴(kuò)增，并與前列腺癌Gleason評(píng)分顯著相關(guān)［31］。

3 NSD3S與BRD4、C-MYC在腫瘤發(fā)生中的機(jī)制

BRD4是溴區(qū)結(jié)構(gòu)域和末端外域（bromodomain and extraterminal，BET）蛋白家族成員之一，可以通過溴區(qū)結(jié)構(gòu)域與乙?；M蛋白結(jié)合，也可以通過磷酸化RNA pol Ⅱ來刺激轉(zhuǎn)錄延伸［35］。C-MYC蛋白（MYC）是一種基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞增殖、代謝、遷移和凋亡等細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中起作用［24］。

研究發(fā)現(xiàn)BRD4存在以下幾個(gè)轉(zhuǎn)錄激活特征：其CTD可直接募集陽性轉(zhuǎn)錄延伸因子b（positive transcriptional elongation factor b，P-TEFb），使RNA pol Ⅱ磷酸化刺激轉(zhuǎn)錄延伸［36］；也可以通過ET結(jié)構(gòu)域與NSD3S的第100～263氨基酸序列結(jié)合［37］，后者第384～645氨基酸序列與CHD8結(jié)合，形成BRD4-NSD3S-CHD8相互作用，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活［33］。BRD4、NSD3S和CHD8在AML基因組中共定位，在使用BET抑制劑治療時(shí)，它們可以從超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)域釋放出來［33］。研究發(fā)現(xiàn)NSD3與BRD4形成的復(fù)合物可調(diào)控H3K36的甲基化水平，使H3K36me3在轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域富集，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄延伸，敲除或沉默NSD3，會(huì)導(dǎo)致H3K36me3水平降低，從而使基因轉(zhuǎn)錄停滯［37］。在NSD3-NUT融合的NMC細(xì)胞系（1221細(xì)胞系）中，NSD3的N端與BRD4的ET域結(jié)合，使用BET抑制劑，可誘導(dǎo)NMC細(xì)胞分化并抑制增殖［22］。

NSD3S與BRD4結(jié)合后，其PWWP結(jié)構(gòu)域直接募集MYC，形成BRD4-NSD3S-MYC 相互作用。BRD4 在BRD4-NSD3-MYC途徑中，通過獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄機(jī)制調(diào)節(jié)MYC；也可以通過BRD4-pTEFb介導(dǎo)的途徑調(diào)節(jié)MYC，從而穩(wěn)定MYC蛋白水平并增加轉(zhuǎn)錄活性［24］，敲除NSD3S可導(dǎo)致MYC在mRNA和蛋白水平的表達(dá)下降。BRD4已證實(shí)可通過MYC啟動(dòng)子下游的超級(jí)增強(qiáng)子來調(diào)節(jié)AML細(xì)胞中MYC的表達(dá)［33］。NSD3S可干擾F-box和WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域（F-box and WD repeat domain containing 7，F(xiàn)BXW7）介導(dǎo)的蛋白酶體降解，來穩(wěn)定MYC蛋白并增強(qiáng)其的半衰期和轉(zhuǎn)錄活性［38］。隨后發(fā)現(xiàn)茶黃素3（theaflavin 3，30-digallate，TF-3），是NSD3/MYC相互作用的抑制劑，通過降低MYC的表達(dá)水平來抑制NSD3/MYC蛋白的相互作用，防止腫瘤的發(fā)生［39］。最新研究發(fā)現(xiàn)NSD3的PWWP1結(jié)構(gòu)域特效拮抗劑BI-9321（甲基咪唑類），可特異性的針對(duì)該結(jié)構(gòu)域的組蛋白賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)，在AML細(xì)胞系MOLM-13和RN2中，可下調(diào)MYC基因的信使RNA的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖，并增強(qiáng)BRD4抑制劑在MOLM-13細(xì)胞中的作用。這表明可使用BI-9321與BRD4拮抗劑聯(lián)合抑制NSD3-PWWP1，為治療與NSD3相關(guān)腫瘤提供一種新的治療策略［40］。

4 展望

NSD3 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用并與腫瘤預(yù)后及復(fù)發(fā)密切相關(guān)，是目前新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化型致癌基因。本文綜合闡述NSD3 在腫瘤中的生物學(xué)功能，除了擴(kuò)增過表達(dá)、局部缺失外還可以與NUP98、NUT、BRD4、CHD4以及MYC形成融合蛋白或相互作用，從而促進(jìn)腫瘤周期進(jìn)程，增加腫瘤侵襲能力。在NSD3 三種轉(zhuǎn)錄蛋白中以NSD3S 致癌作用最強(qiáng)，雖然只有一個(gè)PWWP 結(jié)構(gòu)域，但能在不具備甲基轉(zhuǎn)移酶活性的情況下獨(dú)立促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，如NMC；而NSD3L 致癌作用卻不如NSD3S；目前研究WHISTLE可以抑制基因轉(zhuǎn)錄，是抑癌蛋白，但機(jī)制尚不清楚。目前尚無針對(duì)NSD3 抑制劑，提示需要進(jìn)一步對(duì)NSD3上、下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行研究，為今后腫瘤的臨床治療和預(yù)后提供有價(jià)值的指導(dǎo)。