豬冷凍精液生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)體系及配套設(shè)備推廣應(yīng)用研究

倪和民 蘇 月 趙俊金 鄧曉彬 邢 凱 王相國*

（1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.全國畜牧總站，北京 100193；3.北京田園奧瑞生物科技有限公司，北京 100096）

1 前言

我國人口占世界總?cè)丝诩s19.0%；豬肉消費(fèi)量占世界豬肉消費(fèi)量49.6%；豬肉在中國國內(nèi)肉類產(chǎn)量和消費(fèi)量占比為63.4%。生豬養(yǎng)殖量占世界生豬總養(yǎng)殖量56.6%；生豬飼養(yǎng)產(chǎn)值超過1.5萬億；存欄4.3億頭，年出欄生豬6.9億頭，能繁母豬4000萬頭，種公豬20～25萬頭。疫病和種豬育種繁殖是目前制約我國生豬發(fā)展的關(guān)鍵問題。我國是世界上引進(jìn)種豬最多的國家，中國特色的品種育成率較低，地方良種豬日漸減少，有的已瀕臨滅絕。母豬年提供商品仔豬比國外先進(jìn)水平少8～10頭，因此，未來提升空間很大[1]。

豬冷凍精液技術(shù)是指利用液氮霧等作冷卻源，將精液特殊處理后，保存在超低溫的液氮（-196℃）狀態(tài)下，達(dá)到長期保存的目的，并且經(jīng)解凍后輸精的過程。豬冷凍精液技術(shù)的應(yīng)用使17℃常溫豬精液保存期從普遍的3～5 d變成永久保存，降低引種及飼養(yǎng)管理成本，降低養(yǎng)殖企業(yè)的引種及飼養(yǎng)成本，使優(yōu)秀種公豬的遺傳資源不再受時間和空間限制；優(yōu)秀種公豬精液可以持續(xù)大量生產(chǎn)、保存、運(yùn)輸，可使更多養(yǎng)殖場（戶）使用到高育種值的公豬精液，最大限度發(fā)揮優(yōu)良種豬的繁殖潛力[1]。此外，通過對精液中病原檢測可確保遺傳交流的安全性，降低垂直傳播疾病的風(fēng)險，為豬場的生產(chǎn)安全提供保障[2]。

然而，目前我國的生豬繁育依然以常溫精液輸精為主，約占87.17%。冷凍精使用率低，只有0.83%。主要是豬精液冷凍技術(shù)在過去很長時間內(nèi)未有突破，豬冷凍精液制作程序復(fù)雜且各個操作沒有統(tǒng)一規(guī)范，缺乏相應(yīng)生產(chǎn)過程控溫設(shè)備，適宜規(guī)范化推廣的冷凍試劑組合套裝。最終導(dǎo)致解凍后精子的活力較低，畸形率高，在生產(chǎn)應(yīng)用時程序繁瑣、操作難度大，配種后妊娠率低，妊娠后窩產(chǎn)子數(shù)少等多種問題，嚴(yán)重限制了豬冷凍精液技術(shù)在生豬養(yǎng)殖中的應(yīng)用[3-4]。

本研究根據(jù)豬精子獨有的生理特點經(jīng)過10幾年的科研攻關(guān)，研發(fā)了生產(chǎn)豬精子冷凍溫度各種精準(zhǔn)控制設(shè)備，篩選了廣泛應(yīng)用的冷凍組合試劑盒，規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化了冷凍和解凍程序，創(chuàng)新了豬冷凍精液推廣應(yīng)用新的模式，實現(xiàn)豬冷凍精液技術(shù)的實質(zhì)性突破進(jìn)而廣泛推廣應(yīng)用。

2 研究方法

2.1 精液冷凍設(shè)備和試劑盒

2.1.1 冷凍精液生產(chǎn)設(shè)備

本研究通過自主研發(fā)，自主組裝豬精液冷凍技術(shù)的集成所需要的配套冷凍精液生產(chǎn)設(shè)備，主要設(shè)備有精子分析系統(tǒng)、細(xì)管噴碼機(jī)、大容量精液離心機(jī)、程控平衡儀、細(xì)管灌裝機(jī)、程控冷凍儀和凍精解凍杯。

2.1.2 冷凍精液試劑組合試劑盒

本研究將研發(fā)并推出的國內(nèi)首個豬凍精集成技術(shù)的豬冷凍精液試劑盒，包括A、B、C、D、E五種成分試劑。其中試劑A是預(yù)稀釋專用稀釋劑，與原精1∶1稀釋，避免精子損傷。試劑B是冷凍稀釋液基礎(chǔ)成分，溶于水后按照4∶1的比例加上蛋黃，便可用作離心后精液的初步稀釋，稱作I液（冷藏保護(hù)劑），保護(hù)精子降溫過程不受冷打擊。I液基礎(chǔ)上加入豬冷凍精液試劑C和D，稱作II液（冷凍保護(hù)劑），用于精液二次稀釋。試劑E是解凍劑，使解凍后精子充分復(fù)蘇。該試劑精準(zhǔn)科學(xué)地配比滲透壓、pH、葡萄糖、甘油、二甲基亞砜等劑量和指標(biāo)，確保精子細(xì)胞安全越過低溫和超低溫的冷打擊，將損耗和損失降到最低。

2.2 豬冷凍精液生產(chǎn)制作技術(shù)程序

豬冷凍精液生產(chǎn)制作幾個關(guān)鍵的步驟包括精液采集、精液質(zhì)量分析檢測、精液預(yù)稀釋、17℃平衡、精液離心、4℃平衡，然后加入冷凍保護(hù)劑灌裝封口進(jìn)行冷凍和保存。具體操作步驟參照北京田園奧瑞生物科技有限公司冷凍精液試劑組合試劑盒說明書進(jìn)行操作，利用自主研發(fā)，自主組裝豬精液冷凍技術(shù)的集成所需要的配套冷凍精液生產(chǎn)設(shè)備進(jìn)行精確的時間、溫度和質(zhì)量控制[5]。

2.3 豬冷凍精液生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)體系及配套設(shè)備推廣應(yīng)用

（1）本研究通過選取典型地域的廣西、湖南、河北和北京地區(qū)建設(shè)凍精站進(jìn)行不同品種公豬鮮精不同活力冷凍前后對比和生產(chǎn)。主要對比指標(biāo)包括精子凍前活力、凍精頭次、合格凍精數(shù)、解凍后活力、頂體完整率和畸形率。

（2）將生產(chǎn)的凍精進(jìn)行配種并與鮮精進(jìn)行妊娠數(shù)、妊娠率、窩產(chǎn)仔數(shù)和窩產(chǎn)活仔數(shù)對比。

（3）統(tǒng)計北京匯佳源牧業(yè)科技有限公司、上海祥欣畜禽有限公司、貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所和河北省唐山市玉田豬場在2019至2020年在凍精生產(chǎn)與銷售中的利潤。

2.4 統(tǒng)計分析

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)初步整理和SPSS 17.0軟件進(jìn)行多重比較（One-way ANOVA）和顯著性檢驗。

3 結(jié)果

3.1 不同品種種公豬鮮精不同活力冷凍前后對比

為了證明豬冷凍精液制作體系的穩(wěn)定性，我們選取了北京田園奧瑞、河北、湖南和廣西4個具有不同地域特點的凍精站，推廣使用我們的豬冷凍精液技術(shù)程序、設(shè)備和試劑。大白、長白和杜洛克種公豬精子冷凍-解凍結(jié)果顯示，冷凍前精子活力高，冷凍后精子平均活力精子和頂體完整率同樣高。冷凍前精子活力高于80，其解凍后平均活力、頂體完整率和畸形率沒有明顯變化。而低于冷凍前精子活力低于80的精子其解凍后平均活力和頂體完整率降低明顯，畸形率明顯升高，不適宜進(jìn)行凍精生產(chǎn)（表1-3）。另外，該豬冷凍精液技術(shù)體系并沒有隨著地域的改變出現(xiàn)顯著的效率降低現(xiàn)象，可以適宜全國范圍各種地域特點的種公豬進(jìn)行冷凍精液生產(chǎn)。

表1 不同地區(qū)長白種公豬鮮精不同活力冷凍前后對比

表2 不同地區(qū)大白種公豬鮮精不同活力冷凍前后對比

表3 不同地區(qū)杜洛克種公豬鮮精不同活力冷凍前后對比

3.2 冷凍精液與常溫精液配種應(yīng)用情況對比

通過分別比較大白、長白和杜洛克的冷凍精液和常溫精液配種后的妊娠數(shù)、妊娠率、窩產(chǎn)仔數(shù)和窩產(chǎn)活仔數(shù)結(jié)果顯示，大白、長白和杜洛克冷凍精液配種后的妊娠數(shù)、妊娠率、窩產(chǎn)仔數(shù)和窩產(chǎn)活仔數(shù)分別略微低于其同品種的常溫精液（表4）。使用該冷凍精液技術(shù)包含的豬冷凍精液試劑組合套裝和冷凍設(shè)備在主要的豬品種繁殖效率上基本接近與常溫精液，技術(shù)成熟，設(shè)備可靠，能夠保證在不同品種上的繁殖穩(wěn)定性，能夠進(jìn)行大范圍的推廣。

表4 冷凍精液和常溫精液配種應(yīng)用統(tǒng)計

3.3 冷凍精液應(yīng)用不同方式的利潤統(tǒng)計

北京匯佳源牧業(yè)科技有限公司主要通過6元/支買進(jìn)凍精，10元/支銷售凍精的方式獲得利潤，2019年銷售1.7萬支，2020年銷售3.2萬支。上海祥欣畜禽有限公司采用項目中的程控平衡儀、豬凍精試劑、凍精生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)操作規(guī)程等生產(chǎn)豬冷凍精液，將優(yōu)良基因給予永久保存并逐代傳遞；2019年共計生產(chǎn)豬凍精20萬支，銷售12萬支，銷售額600萬元；2020年銷售8萬支，銷售額400萬元。貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所采用項目中的凍精生產(chǎn)配套設(shè)備精子分析系統(tǒng)、精子密度儀、細(xì)管噴碼機(jī)、細(xì)管灌裝機(jī)、程控平衡儀、程序冷凍儀、豬凍精試劑、凍精生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)操作規(guī)程等生產(chǎn)豬冷凍精液，將地方品種資源予以長期保存。河北省唐山市玉田豬場2018年受非洲豬瘟影響，不敢貿(mào)然使用鮮精，采用凍精配種。2019年配種260窩，總產(chǎn)仔數(shù)1681頭；2020年配種50窩，總產(chǎn)仔數(shù)497頭。累計新增銷售額385.17萬元，新增利潤167.37萬元。

4 討論

4.1 豬精液冷凍技術(shù)關(guān)鍵技術(shù)仍需解決

冷凍精液推廣過程中難免會遇到特殊情況，比如豬品種、冷凍技術(shù)體系、冷凍操作方法、冷凍配方不適用的情況，導(dǎo)致冷凍精液效果不佳。另外，目前的冷凍精液生產(chǎn)工藝還需要一定的技術(shù)性，冷凍精液解凍、配種也需要一套固定的操作流程，相比常溫精液配種更加煩瑣。因此，還需要各個研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)進(jìn)行聯(lián)合研發(fā)，進(jìn)行各種冷凍精液冷凍機(jī)理研究，提高冷凍精液解凍后活力和頂體完整率，提高受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，優(yōu)化凍精的使用程序，最終提高冷凍精液生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

4.2 設(shè)備生產(chǎn)的產(chǎn)能還需加強(qiáng)

目前國內(nèi)只有北京田園奧瑞生物科技有限公司一家公司生產(chǎn)研發(fā)冷凍精液設(shè)備，由于沒有配套產(chǎn)業(yè)鏈環(huán)境，設(shè)備研發(fā)投入大，進(jìn)展慢，設(shè)備智能化程度不高，制約了冷凍精液生產(chǎn)效率。同時，冷凍精液實驗室配套生產(chǎn)設(shè)備需要八十多萬元，比常溫精液高出三至四倍，高投入澆滅了一部分公豬站的熱情。因此，需要聯(lián)合好的設(shè)備制造企業(yè)進(jìn)行凍精設(shè)備的生產(chǎn)，降低設(shè)備的生產(chǎn)成本。

4.3 目標(biāo)客戶對豬冷凍精液人工輸精技術(shù)體系的認(rèn)識還需提升

長期以來，不論是國內(nèi)外發(fā)表的豬精液冷凍技術(shù)相關(guān)的論文還是相關(guān)領(lǐng)域的專家對豬冷凍精液技術(shù)的評價，即：解凍后的活力和配種效果都不太理想。豬冷凍精液解凍后的精子活力最初只有30%左右，雖然近年上升到50～60%，仍然不能滿足商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用時精子活力需達(dá)到70%以上的需求，僅僅將這項技術(shù)用于保種和引種。另外，冷凍精液生產(chǎn)繁育的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)都還難以與常溫精液媲美，生產(chǎn)數(shù)據(jù)較少。綜合因素導(dǎo)致了目標(biāo)客戶對目前的豬冷凍精液技術(shù)的認(rèn)知程度還停留在以前的水平，為了保障自身經(jīng)濟(jì)效益，在應(yīng)用豬冷凍精液時較慎重，這也阻礙了目前豬冷凍精液的商業(yè)化推廣應(yīng)用。

4.4 應(yīng)用前景

目前，豬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)和解凍技術(shù)已經(jīng)可以穩(wěn)定達(dá)到凍精解凍后活力≥60%，本研究證實自主研發(fā)的國產(chǎn)凍精設(shè)備試劑極大地降低了凍精生產(chǎn)成本，加上配套成熟的母豬發(fā)情檢測鑒定和深部輸精技術(shù)，受胎率和產(chǎn)仔數(shù)接近鮮精而逐步被養(yǎng)豬企業(yè)接受，特別是在新型冠狀病毒肺炎疫情防控導(dǎo)致常溫精液運(yùn)輸受限，非洲豬瘟疫情一段時間內(nèi)仍將威脅豬場安全的情況下，豬冷凍精液的戰(zhàn)略儲備和生物安全價值凸顯，豬冷凍精液將在地方豬品種保護(hù)和優(yōu)質(zhì)種豬保種上發(fā)揮較大作用，同時，大量存儲冷凍精液的凍精銀行不僅可以打通壁壘實現(xiàn)聯(lián)合育種，也是“穩(wěn)產(chǎn)保供”，加快恢復(fù)生豬生產(chǎn)，快速擴(kuò)繁的重要戰(zhàn)略儲備，加快豬冷凍精液的生產(chǎn)儲備和推廣應(yīng)用勢在必行。

4.5 未來仍具有技術(shù)提高空間

通過研究精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，滲透壓變化，膜表面磷脂雙分子變化，DNA完整性，受精能力在不同冷凍-解凍過程中的變化機(jī)理。甄選精液抗氧化劑和抗凍劑，研發(fā)新的精液冷凍保護(hù)劑，冷凍配方，優(yōu)化冷凍程序，降低冷凍對精子活力的影響。蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)確定那些更精確和可預(yù)測的遺傳和蛋白質(zhì)標(biāo)記，從而排除繁殖效率低下的公豬。改進(jìn)完善輸精技術(shù)體系，在保證受胎率和產(chǎn)仔數(shù)的前提下，使冷凍精液一次輸精量從現(xiàn)在的8～10億個減少到4～8億個，提高國產(chǎn)種豬的使用效率，從而減少種公豬的飼養(yǎng)數(shù)量。