小麥籽粒PPO活性檢測方法改良與應(yīng)用

翟勝男，李豪圣，宋健民，劉愛峰，曹新有，程敦公， 趙振東，何中虎，夏先春，劉建軍

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東濟(jì)南 250100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

色澤是小麥面粉及面制品品質(zhì)評價的重要指標(biāo)[1-2]。小麥籽粒多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)催化酚類物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生醌類物質(zhì)或催化多酚類變?yōu)檠鹾硝?，后者發(fā)生自身非酶促聚合或與蛋白質(zhì)氨基酸殘基或糖類發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生褐色或黑色的沉積物，是造成面粉及其制品酶促褐變的最主要原因[3-6]，可以解釋面粉及其制品加工儲藏過程中50%～70%的顏色褐變[7-8]。PPO不僅影響面制品表觀色澤，還影響食品特性及營養(yǎng)品質(zhì)，因而倍受面粉加工企業(yè)和育種家的關(guān)注[9-10]。培育低籽粒PPO活性小麥品種，是對面制品色澤性狀進(jìn)行改良的重要途徑，已成為小麥品質(zhì)育種的重要目標(biāo)。如何準(zhǔn)確、快速、簡便地測定小麥籽粒PPO活性，是育種家們急需解決的問題。

利用分光光度法，以鄰苯二酚和L-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA，L-dihydroxyphenylalanine)為底物，是目前測定小麥籽粒PPO活性最為常見的兩種方法[11-12]。Kruger等[7]和McCaig等[13]提出以鄰苯二酚為底物進(jìn)行小麥籽粒PPO活性的測定，該方法大大提高了PPO活性檢測的精度和效率，操作簡便，費(fèi)用低。Anderson和Morris[14]及Bettge[15]提出以L-DOPA為底物測定小麥籽粒PPO活性，進(jìn)一步提高了小麥籽粒PPO活性檢測精度，該方法已被美國谷物化學(xué)協(xié)會(AACC，American Association for Cereal Chemistry)作為標(biāo)準(zhǔn)方法(AACC 22-85)，被廣泛應(yīng)用。AACC分析方法第11版中，將其修訂為AACC 22-85.01[16]。

然而，分光光度法測定PPO活性的檢測通量很低，只能對樣本逐個進(jìn)行檢測，操作繁瑣，測定時間長，工作量大，檢測效率低。酶標(biāo)儀工作原理和分光光度計類似，且具有操作簡便、精度高、樣品微量、檢測效率高等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于三角褐指藻油脂含量、食用菌多糖含量、大豆總皂甙含量等的檢測[17-19]。

為了提高檢測效率和穩(wěn)定性，為PPO活性高通量檢測和面制品色澤性狀遺傳改良提供技術(shù)支撐，本研究將酶標(biāo)儀檢測技術(shù)應(yīng)用于小麥面粉PPO活性測定，對傳統(tǒng)AACC 22-85.01法進(jìn)行改良，并對改良方法的有效性進(jìn)行了驗證，利用改良方法對283份國內(nèi)外小麥品種進(jìn)行PPO活性檢測，篩選籽粒PPO活性較低品種，為培育低籽粒PPO活性小麥品種的親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

根據(jù)前人研究，選用26個籽粒PPO活性變異范圍較大的小麥品種，包括衡觀33、淮麥21、冀師02-1、蘭考906、臨麥2號、魯麥21、魯麥8號、洛旱2號、陜354、陜715、ProINTA Colibr 1、陜麥94、Aca 601、石新733、泰山1號、皖麥33、小偃22、小偃54、宿0663、煙農(nóng)19、豫麥2號、鄭9023、中麥871、中育5號、周麥25和淄選2號，分別采用傳統(tǒng)AACC 22-85.01法[17]與改良方法測定PPO活性，用于驗證改良AACC 22-85.01法的準(zhǔn)確性。選用144份我國黃淮麥區(qū)小麥品種，用于分析改良方法的重演性和穩(wěn)定性。對283份具有代表性的國內(nèi)外小麥品種用改良方法進(jìn)行籽粒PPO活性檢測。根據(jù)生育期和春冬性不同，于2012—2013和2013—2014年度進(jìn)行分區(qū)種植。其中，144份我國黃淮麥區(qū)小麥品種種植于河南安陽和安徽濉溪；42份北部冬麥區(qū)品種和48份國外品種種植于北京和河北石家莊；49份長江中下游麥區(qū)品種種植于安徽濉溪和四川成都。

所有供試材料采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，4行區(qū)，行長2 m，行距25 cm。試點均經(jīng)過多年的科學(xué)管理和改善，土壤地力充裕，肥力均勻，田間管理同大田生產(chǎn)。對收獲籽粒進(jìn)行磨粉，用于PPO活性測定。

1.2 制 粉

應(yīng)用單籽粒谷物特性測試儀SKCS 4100(Perten，Sweden)測定籽粒硬度。利用近紅外分析儀Foss-Tecator 1241(Sweden)測定籽粒蛋白質(zhì)含量和含水量。根據(jù)硬度等級計算潤麥所需加水量：軟質(zhì)麥(硬度指數(shù)<40)為14%、混合麥(40<硬度指數(shù)<60)為15%、硬質(zhì)麥(硬度指數(shù)>60)為16%。室溫潤麥16～18 h，應(yīng)用Junior實驗?zāi)?Branbender，Germany)制粉，出粉率約為60%。面粉4 ℃保存，用于PPO活性檢測。

1.3 PPO活性測定

分別利用傳統(tǒng)AACC 22-85.01法[17]與改良方法測定26個籽粒PPO活性變異范圍較大的小麥品種的籽粒PPO活性。

傳統(tǒng)AACC 22-85.01法[17]：5粒完整小麥種子置于2 mL離心管中；加入1.5 mL反應(yīng)試劑[50 mM MOPS(3-N-Morpholino propanesulfonic acid，pH 6.5)緩沖液配制的10 mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenyl alanine)]；離心管放入往復(fù)振蕩器上，振蕩1 h，樣品充分暴露在空氣中；吸取1 mL反應(yīng)液加入比色皿中，以L-DOPA/MOPS溶液作為對照，利用分光光度計測定反應(yīng)液在475 nm下的吸光值。每個樣品重復(fù)2次，均值作為樣品PPO活性的表型值。如果兩個吸光值差異大于0.15，則進(jìn)行第三次測定。

參照Mohammadi等[20]方法，對傳統(tǒng)AACC 22-85.01法[17]進(jìn)行改良，具體步驟如下：

(1)稱取0.2 g面粉置于50 mL離心管中；

(2)加入1.5 mL反應(yīng)試劑[50 mM MOPS(3-N-Morpholino propanesulfonic acid，pH 6.5)緩沖液配制的10 mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenyl alanine)]，迅速旋渦振蕩、混勻；

(3)將50 mL離心管放入往復(fù)振蕩器上，200 r·min-1、22 ℃振蕩30 min，樣品充分暴露在空氣中；

(4)將反應(yīng)液迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)先冷卻的2 mL離心管中，并插入冰中5 min終止反應(yīng)；

(5)反應(yīng)液在冷凍離心機(jī)中4 ℃ 5 000 r·min-1離心10 min；

(6)吸取200 μL上清液加入96孔酶標(biāo)板(Costar 3590，USA)，以L-DOPA/MOPS溶液作為對照，利用酶標(biāo)儀SpectraMax Plus 384(Molecular Devices，LLC，USA)測定上清液在475 nm下的吸光值，計算PPO活性值，單位為 U·g-1·min-1。

L-DOPA現(xiàn)配現(xiàn)用。應(yīng)用改良方法測定283份國內(nèi)外小麥品種籽粒PPO活性，每個樣品重復(fù)3次，均值作為樣品PPO活性的表型值。

1.4 統(tǒng)計分析

利用SAS V9.2(http://www.sas.com)軟件進(jìn)行PPO活性基本數(shù)據(jù)分析，利用PROC CORR程序進(jìn)行相關(guān)性分析，應(yīng)用PROC GLM程序進(jìn)行方差分析。利用Microsoft Excel軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)AACC 22-85.01法與改良方法所測PPO活性比較

對兩種方法所測26個小麥品種籽粒PPO活性進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示，傳統(tǒng)方法所測PPO活性值較高，平均值為11.51 U·g-1·min-1，變化范圍為6.04 U·g-1·min-1～ 19.16 U·g-1·min-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.03%～6.16%，變異系數(shù)為 32.3%。改良方法所測PPO活性值較低，平均值為5.63 U·g-1·min-1，變化范圍為3.35 U·g-1·min-1～8.80 U·g-1·min-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.11%～ 4.92%，變異系數(shù)為27.9%。兩種方法所測PPO活性呈極顯著正相關(guān)(R=0.982，P<0.001)。

圖1 兩種方法所測PPO活性的相關(guān)性Fig.1 Correlation of PPO activities measured by the two methods

由表1可知，重復(fù)對兩種方法的檢測結(jié)果均無顯著影響，說明試驗過程人為因素影響很小。品種對兩種方法所測小麥籽粒PPO活性值均有極顯著影響。

2.2 傳統(tǒng)AACC 22-85.01法與改良方法的差異性比較

如表2所示，與傳統(tǒng)AACC 22-85.01法相比，改良AACC 22-85.01法以面粉為試驗材料，反應(yīng)時間縮短至30 min，應(yīng)用96孔板和酶標(biāo)儀代替比色皿和分光光度計，同時可檢測多個樣本，大大提高了檢測效率。

2.3 改良AACC 22-85.01法測定PPO活性穩(wěn)定性分析

為了分析本研究改良AACC 22-85.01法測定PPO活性的穩(wěn)定性和可靠性，應(yīng)用此方法對144份我國黃淮麥區(qū)代表性小麥品種的PPO活性進(jìn)行重復(fù)測定。結(jié)果如圖2所示，三次重復(fù)間PPO活性相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.993～0.994，呈極顯著正相關(guān)(P<0.001)，表明改良AACC 22-85.01法測定PPO活性重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。

表1 兩種方法測定PPO活性的方差分析Table 1 Analyses of variance of PPO activities measured by the two methods

表2 兩種PPO活性測定方法比較Table 2 Comparison of the two methods for detecting PPO activity

圖2 改良AACC 22-85.01法測定PPO活性3次重復(fù)間的相關(guān)性Fig.2 Correlation of PPO activities between three replicates measured by the modified AACC 22-85.01 method

2.4 283份國內(nèi)外小麥品種PPO活性分析

由表3可知，283份國內(nèi)外小麥品種籽粒PPO活性變異范圍廣，遺傳基礎(chǔ)豐富。黃淮麥區(qū)小麥品種PPO活性為1.98 U·g-1·min-1～ 9.37 U·g-1·min-1，平均值為4.72 U·g-1·min-1；北部冬麥區(qū)小麥品種PPO活性為1.72 U·g-1·min-1～8.76 U·g-1·min-1，平均為4.34 U·g-1·min-1；長江中下游麥區(qū)小麥品種PPO活性為1.89 U·g-1·min-1～8.40 U·g-1·min-1，平均為3.86 U·g-1·min-1；國外小麥品種PPO活性為1.92 U·g-1·min-1～10.47 U·g-1·min-1，平均為5.85 U·g-1·min-1。

同一品種不同環(huán)境間PPO活性的相關(guān)系數(shù)為0.65～0.97。比較各個品種在不同環(huán)境下PPO活性值，發(fā)現(xiàn)在不同環(huán)境間穩(wěn)定且PPO活性較低的品種34個(表4)，可作為培育低籽粒PPO活性小麥新品種的優(yōu)異資源。

表3 283份小麥品種PPO活性Table 3 PPO activity of the 283 wheat varieties

表4 具有低PPO活性的小麥品種Table 4 Wheat varieties with low PPO activity

3 討 論

小麥籽粒PPO是造成面制品顏色褐變的最主要原因，培育低籽粒PPO活性品種已成為小麥品質(zhì)改良的重要目標(biāo)[21]。目前，對小麥PPO的研究主要集中在PPO活性與面制品色澤的關(guān)系[4,6,8]、QTL定位[22-24]、基因克隆及分子標(biāo)記開發(fā)[25-27]等方面。準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定、簡便的PPO活性檢測方法是上述研究的基礎(chǔ)。

測定PPO活性的方法主要分為兩大類，耗氧電極法和分光光度法[15]。耗氧電極法主要是由于PPO催化反應(yīng)需要消耗氧，溶液中氧濃度的減少速率與酶活力大小成正比，因而可以用單位時間內(nèi)的耗氧量來表示PPO活性[12]。該方法精度極高但測定時要嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度。此外，新磨制的面粉由于脂肪氧化酶活性較強(qiáng)，其催化不飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)也耗氧，對測定結(jié)果可能有一定影響。而分光光度法主要是測定單位時間內(nèi)PPO催化酚類反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的變化來反映

PPO的活性[13,28]，可以用不同的化學(xué)試劑為底物進(jìn)行PPO活性測試。AACC22-85.01法[17]以L-DOPA為底物，利用分光光度計測定小麥籽粒PPO活性，由于操作簡便、快速等特點被廣泛應(yīng)用[12]。本研究對AACC 22-85.01法進(jìn)行了改良，利用酶標(biāo)儀檢測PPO活性，結(jié)果顯示，兩種方法測定的PPO活性呈極顯著正相關(guān)，且改良法所測PPO活性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小。用改良法重復(fù)測定144份小麥品種PPO活性，三次重復(fù)間相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.993～0.994，表明該方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。此外，改良法應(yīng)用96孔酶標(biāo)板和酶標(biāo)儀來測定PPO活性，無需更換清洗比色皿，大大減少工作量，同時可檢測多個樣本，縮短檢測時間，避免因測定時間過長而導(dǎo)致的誤差，檢測效率提高約12～15倍。因此，本研究改良的AACC 22-85.01法具有準(zhǔn)確可靠、精密度高、重復(fù)性好、檢測效率高等優(yōu)點，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法用于小麥籽粒PPO活性的高通量檢測，為小麥品種資源篩選和面制品色澤改良提供技術(shù)支撐。

張 曉和田紀(jì)春[29]研究表明，面粉PPO活性與面制品色澤及色澤變化的相關(guān)性最大。因此，在低籽粒PPO活性小麥育種工作中，利用本研究改良的AACC 22-85.01法對高代育種材料面粉進(jìn)行PPO活性測定和篩選，可更準(zhǔn)確預(yù)測面制品顏色褐變程度，提高育種選擇的精準(zhǔn)度。此外，本研究對283份國內(nèi)外小麥品種籽粒PPO活性進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，供試品種PPO活性變異范圍廣，遺傳基礎(chǔ)豐富。共篩選出在不同環(huán)境間PPO活性均較低且穩(wěn)定的小麥品種34份，可作為低籽粒PPO活性小麥品種選育的重要親本 資源。