非洲豬瘟病毒（ASFV）結構蛋白p54的表位定位研究

張愛瓊，賀志昊（編譯）

（畢節(jié)市動物疫病預防控制中心，貴州 畢節(jié) 551700）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重威脅，給中國以及東南亞在內(nèi)的一些國家造成了嚴重的經(jīng)濟損失。急性型ASF感染的豬只在感染后的臨床表現(xiàn)為昏睡、厭食、高燒和死亡；在慢性型ASF中，豬只臨床癥狀要輕得多。由于現(xiàn)今沒有有效的非洲豬瘟疫苗對豬只進行免疫來避免該病毒的感染，疫病的防控嚴重依賴于生物安全與對被感染豬的早期診斷檢測，因此診斷工具對于該病早期發(fā)現(xiàn)和實施控制措施至關重要。

Petrovan V等人基于非洲豬瘟病毒p72和p30抗原應用于酶聯(lián)免疫吸附試驗作為非洲豬瘟血清學檢測的重要工具，對與其他免疫原性蛋白一樣p54結構蛋白進行研究。除p72和p30抗原外，非洲豬瘟的另一個血清學目標是有183個氨基酸的結構蛋白p54，p54是進行ASFV檢測和監(jiān)測的良好血清學靶標，它是病毒基因E183L的產(chǎn)物，位于內(nèi)包膜病毒體中。p54是一種第二型病毒膜蛋白，其內(nèi)部N-末端60個氨基酸，隨后是一個跨膜結構域和一個131個氨基酸的C-末端結構域，據(jù)預測其外域具有幾個糖基化和磷酰化位點。該蛋白質(zhì)具有保守和可變的肽區(qū)，p54蛋白間的差異很大程度上由位于蛋白C端一半的Pro-Ala-Ala-Ala重復序列的數(shù)量決定，基因變異與毒力無關，但有助于將病毒分為不同的基因型。p54與p30共同參與病毒顆粒與靶細胞的結合，在病毒內(nèi)化后，p54與宿主蛋白dynein相互作用，導致病毒粒轉運到細胞的核周區(qū)域，p54中相應的動力蛋白結合結構域（DBD）也參與Caspase-3的激活和凋亡的誘導，位于氨基酸149-161之間的DBD，是ASFV感染豬的對照血清中和目標?？筽54抗體最早在感染后8 d出現(xiàn)，并持續(xù)數(shù)周。Gallardo等人描述的基于p54酶聯(lián)免疫吸附試驗的血清學試驗顯示，與世界動物衛(wèi)生組織的酶聯(lián)免疫吸附試驗相比，敏感性為98 %，特異性為97 %。此外，在37 ℃儲存1個月后，ASFV抗體陽性樣品的p54反應性仍為陽性。因此，p54連同p30和p72是代表了檢測ASFV抗體的一組理想的抗原靶標?？贵w檢測的改進包括并入抗原特異性mAb轉化為封閉ELISA（bELISA）測試，商業(yè)上可用的bELISA測試Ingenasa-Ingezim PPA Compac K3，是基于對p72抗體的檢測。

Petrovan V等人對ASFV表位結構蛋白p54進行研究，首先進行動物實驗獲取血清，同時采用基因工程技術以非洲豬瘟 Georgia2007/1株（GenBank登 錄 號：FR682468）為模板，用特異性引物F:5′-TTGGCCAACTTGATAGC-3′和R:5′-ATACGTGCGTCGATGGAGA T-3′擴增包含60-178氨基酸的p54基因的核苷酸序列（沒有預測的跨膜區(qū)域），并將其克隆到pFastBac/HBMTOPO載體（InvitrogenBac-to-BacHBMTO P）中，轉化到桿狀病毒穿梭載體（bacmid）中。運用重組桿菌DNA轉染SF9和Hi-Five昆蟲細胞，用附著在C端的6×His標簽表達p54融合蛋白。該蛋白在桿狀病毒感染的細胞中表達，并用HisPurTM Cobalt色譜Cartridge（Thermo Fisher）純化，然后進行小鼠的免疫和單克隆抗體（mAbs）的制備。同時，其以ASFV BA71 V株（GenBank登錄號U18466）的p54基因序列用于制備密碼子優(yōu)化的p54多肽片段（集成技術）。為5個多肽片段制備了合成的DNA片段；p54（54-113）、p54（83-143）、p54（113-183）、p54（1-183） 和p54（54-183），在每個DNA片段的5′和3′末端插入SacII和EcoRI限制性酶切位點，并被克隆到表達5xHis泛素融合蛋白的細菌表達載體中，將質(zhì)粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，并進行多肽的表達和純化。在純化后進行酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和病毒中和試驗。

其結果顯示，除p54（1-183）外，所有重組蛋白都在大腸桿菌中表達，為5xHis-泛素融合蛋白（添加5xHis-泛素標簽是為了親和純化和提高大腸桿菌中的蛋白表達）。全長蛋白p54（1-183）在沒有泛素的情況下表達。多肽片段p54（54-113）、p54（83-143）和p54（113-183）在天然條件下使用試劑盒中提供的緩沖液進行親和純化，在天然緩沖液純化條件下不溶的p54（1-183）蛋白在8 M尿素存在下純化。p54（54-183）多肽也是不溶的，但在較溫和的條件下用CAPS/Sarkosyl緩沖液純化，用5xHis單克隆抗體免疫印跡的SDS PAGE顯示所有p54多肽構建體如預期遷移。

最初針對桿狀病毒表達的Georgia p54（60-178）多肽篩選了單克隆抗體，用于免疫小鼠。免疫熒光試驗（IFA）在固定的ASFV Lisbon/60感染的Vero細胞上篩選12種陽性單克隆抗體，結果確定了7個IFA陽性克隆。由于肽序列的相似性，來自Lisbon/60和BAV71 V的p54多肽可以用作Georgia的替代物。5個IFA陰性克隆沒有進行進一步的研究。通過白細胞和酶聯(lián)免疫吸附試驗篩選出7種IFA陽性單克隆抗體，在抗大腸桿菌中表達的BA71 V p54（1-183）。5個單克隆抗體，對感染了Lisbon/60的Vero細胞進行IFA染色。在涂有大腸桿菌表達的p54（54-183）的平板上進行酶聯(lián)免疫吸附試驗，用大腸桿菌表達的p54（1-183）進行蛋白質(zhì)印跡，重組蛋白基于ASFV BA71 V。對于酶聯(lián)免疫吸附試驗，吸光度值大于陰性對照的3個標準偏差被認為是陽性結果。對典型ASFV分離株p54抗原區(qū)的比較，發(fā)現(xiàn)26種病毒的p54寡肽序列，重新呈現(xiàn)了24種已知ASFV基因型中的20種。當所有5種單克隆抗體在中和試驗中結合時，中和活性存在于所有測試的稀釋液中。

患ASF的病豬血清對p54多肽和寡肽的識別是用ASFV分離物OURT88/3實驗性感染的16頭豬的血清對照p54多肽進行測試。OURT88/3是一種毒性相對較低的分離株，可誘導強有力的抗體反應，結果顯示了多肽p54（54-183）和p54（83-143）的平均吸收率最高，同時血清也與寡肽組反應。

總之，在缺乏有效疫苗的情況下，對ASF的控制依賴于準確、高效和低成本的檢測方法。與p72、p30與pp62一樣，p54屬于一組結構蛋白，具有免疫原性，通常參與疫苗研制和血清學檢測。在其研究中，mAb和感染豬識別的p54中線性抗原結構域的特征提供了有關使用p54作為血清學抗原的信息。以前對抗原區(qū)域的研究僅限于位于DBD氨基酸149-161之間的單個線性表位。但是，其研究中產(chǎn)生的單克隆抗體均未識別出DBD區(qū)域或未顯示出明顯的病毒中和活性。即使DBD肽序列具有抗原性，當用全蛋白免疫小鼠時它可能也沒有足夠的免疫原性。桿狀病毒系統(tǒng)的一個優(yōu)勢是產(chǎn)生具有翻譯后修飾（例如糖基化）的蛋白質(zhì)。即使用于免疫小鼠的p54（60-178）多肽不具有N-糖基化位點（NXS/T），但據(jù)預測它仍具有多個O-糖基化位點，翻譯后修飾對mAbs識別p54的作用尚不清楚。在最初的表位研究中使用了大腸桿菌表達系統(tǒng)，是基于該系統(tǒng)先前已用于生產(chǎn)p54來進行診斷分析。其研究評估了5個mAb用作檢測ASFV感染的試劑（用于抗體或抗原檢測）的能力。開發(fā)用于檢測p54抗體或用于病毒檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗中p54抗原捕獲試驗的b-ELISA的第一步是制備和鑒定識別保守表位的單克隆抗體，產(chǎn)生了一組針對桿狀病毒表達的p54重組蛋白的單克隆抗體。表位定位顯示，來自ASFV感染豬的單克隆抗體和血清識別p54內(nèi)的保守和可變區(qū)域，ASF病豬的血清也能識別表位。這些數(shù)據(jù)為開發(fā)新的血清學檢測方法創(chuàng)造了機會，這些方法可以改善ASF診斷。其研究中描述的5種抗p54mAbs在p54中識別了幾個保守和可變的區(qū)域，共同確定了位于p54上的重要抗原和免疫原性區(qū)域，部分mAbs識別的表位也被AS FV感染豬的血清識別。與其他血清學檢測一起，為改進ASFV診斷提供了新的工具，將有助于改進對ASFV感染的檢測。