ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在作物遺傳育種中的應(yīng)用

牛姣姣

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在作物遺傳育種中的應(yīng)用

牛姣姣

（新鄉(xiāng)學(xué)院河南新鄉(xiāng)453003）

作物遺傳育種是專門研究農(nóng)作物遺傳改良的理論、方法與技術(shù)的科學(xué)；搞好作物遺傳育種，可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)培育優(yōu)良的作物品種。而ISSR分子標(biāo)記技術(shù)則是一項重要的分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)具有較高的穩(wěn)定性與多態(tài)性，成本低廉，可以廣泛應(yīng)用于不同生物基因組多態(tài)性分析中。文章結(jié)合實例，闡述了ISSR技術(shù)在作物遺傳育種中的應(yīng)用。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)；作物；遺傳育種；應(yīng)用

農(nóng)作物同其他任何生物一樣，在繁殖后代的過程中，其子代與親代之間，可以保持著相似的性狀。但在農(nóng)作物長期世代相傳的繁衍過程中，其性狀也可能發(fā)生明顯的變異[1]?！魑镞z傳育種，正是通過研究農(nóng)作物遺傳、變異的規(guī)律，根據(jù)國民經(jīng)濟與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的需要，有意識地培育新的農(nóng)作物品種。搞好作物遺傳育種，可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)培育優(yōu)良的作物品種，從而促進我國農(nóng)業(yè)長期可持續(xù)發(fā)展。

搞好作物遺傳育種，首先需要研究并掌握農(nóng)作物遺傳、變化的規(guī)律。研究農(nóng)作物遺傳、變化規(guī)律，又需要運用分子標(biāo)記技術(shù)。而ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，則是具有極高實用價值的分子標(biāo)記技術(shù)。

1 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)

生物子代個體間的遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列一旦發(fā)生變異，便會留下明顯的遺傳標(biāo)記（生物子代個體基因組中具有明顯差異性的某個DNA片段），這種標(biāo)記稱為DNA分子標(biāo)記[2]。分子標(biāo)記均勻分布于生物子代個體的整個基因組內(nèi)，一旦摸清分子標(biāo)記，便可掌握生物遺傳變異的基本規(guī)律。因此，主要發(fā)達(dá)國家的分子生物學(xué)專家們自20世紀(jì)70年代以來一直在積極研究分子標(biāo)記技術(shù)，并陸續(xù)研發(fā)出十多種分子標(biāo)記技術(shù)。

1994年，加拿大蒙特利爾大學(xué)研發(fā)出ISSR分子標(biāo)記技術(shù)（InterSimpleSequenceRepeat）。ISSR技術(shù)的基本原理是：在真核生物基因組中，每隔一定區(qū)段便有一個簡單序列重復(fù)的SSR序列（也稱微衛(wèi)星DNA）。SSR序列由1～6個核苷酸為重復(fù)單位組成，具有多態(tài)性位點多、信息含量豐富、分布廣泛等特點。因此，可以設(shè)計出與SSR序列相結(jié)合的PCR引物（一對可以擴增SSR序列的合適的核苷酸片段），然后，在PCR引物的3'端或5'端接上2～4個嘧啶堿基或嘌呤，對2個相距較近，方向相反的重復(fù)序列之間的DNA片段進行擴增?！绻蚪M在這些擴增區(qū)域內(nèi)發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變以及其他結(jié)構(gòu)變異，就可能導(dǎo)致這些區(qū)域與引物結(jié)合的數(shù)量和位置發(fā)生改變，從而使PCR擴增片段數(shù)量及長度發(fā)生改變。通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，就可檢測出基因組在這些SSR座位的多態(tài)性[3]。

由于ISSR屬于顯性標(biāo)記，因此，ISSR技術(shù)具有較高的穩(wěn)定性與多態(tài)性，可以為研究對象快速構(gòu)建基因組指紋圖，可以同時檢測基因組多個SSR座位，可以揭示出不同生物基因組中各種簡單重復(fù)序列的組成、變化頻率；采用ISSR技術(shù)，DNA用量少，成本較低，技術(shù)要求低，因此，ISSR技術(shù)在作物遺傳育種中可以大顯身手。

2 在作物遺傳育種中應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)

在過去，人們只能憑經(jīng)驗進行作物遺傳育種；不僅需要耗費大量時間，而且育種的成功概率也非常低。在作物遺傳育種中應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，可以迅速查清作物的基因組序列，為作物構(gòu)建基因組圖譜，調(diào)查作物之間的遺傳相似系數(shù)，從而提高作物遺傳育種的成功率[4]。下面，我們將結(jié)合某農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯雜交育種試驗的實例，闡述如何在作物遺傳育種中應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)。

2017年，北方某農(nóng)業(yè)大學(xué)的專家們選擇內(nèi)蒙古一家試驗農(nóng)場進行了一次馬鈴薯雜交育種試驗。選用的馬鈴薯母本為“JO7-2”“J07-4”“JO7-6”（均為日本馬鈴薯品種），選用的馬鈴薯父本為“隴薯6號”“隴薯7號”。專家們將“隴薯7號”與“JO7-2”進行人工雜交，獲得雜交馬鈴薯種子A；將“隴薯6號”與“J07 -4”進行人工雜交，獲得雜交馬鈴薯種子B；將“隴薯6號”與“JO7-6” 進行人工雜交，獲得雜交馬鈴薯種子C；將“隴薯7號”與“JO7-6”進行人工雜交，獲得雜交馬鈴薯種子D。

專家通過剪取馬鈴薯的嫩葉，提取了該次雜交育種試驗5個父本、母本馬鈴薯的基因組DNA，然后選擇5種ISSR引物，采用電泳檢測，對這5種馬鈴薯進行了ISSR分子鑒定。

5種ISSR引物分別為：

（1）AF 18550，序列為5’-CTCTCTCTCTCTCTCTAC-3’。

（2）AW20617，序列為5’-AGCAGCAGCAGCAY-3’。

（3）AW75511，序列為5’-ACACACACACACACACY G-3’。

（4）AW20607，序列為5’-AGAGAGAGAGAGAGAGY T-3’。

（5）AF18549，序列為5’-AGAGAGAGAGAGAGAGC T-3’。

而后，專家又提取了4個雜交馬鈴薯種子的基因組DNA，對它們也進行了ISSR分子鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

雜交馬鈴薯種子A的基因組DNA中，擴增出2條父本特征帶，5條父母本共有帶，2條新增條帶（新增帶條與父本特征帶、母本特征帶相比存在明顯差異）。

雜交馬鈴薯種子B的基因組DNA中，擴增出2條父母本共有帶，1條父本特征帶，1條母本特征帶。

雜交馬鈴薯種子C的基因組DNA中，擴增出2條父母本共有帶，5條父本特征帶。

雜交馬鈴薯種子D的基因組DNA中，擴增出3條父母本共有帶、2條父本特征帶、1條新增條帶（新增帶條與父母本帶相比存在明顯差異）。

馬鈴薯屬于自花授粉植物，通過人工授粉進行雜交育種，很容易產(chǎn)生偽雜種。因此，必須采用形態(tài)學(xué)或細(xì)胞學(xué)方法鑒定雜種的真實性。但形態(tài)學(xué)標(biāo)志鑒定方法（主要研究植物體的質(zhì)量性狀與外部形態(tài)特征）、細(xì)胞學(xué)標(biāo)志鑒定方法（主要研究植物體內(nèi)染色體核型與染色體帶型）需要耗費大量的時間，而且反映的遺傳信息量也比較少[5]。采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，則克服了形態(tài)學(xué)鑒定方法與細(xì)胞學(xué)鑒定方法的缺陷。

在此次馬鈴薯雜種鑒定中，專家們進行了ISSR分子鑒定，快速提取了馬鈴薯雜交種子的大量遺傳信息，在短時間內(nèi)證實了雜種的真實性[6]。

其后，專家將雜交馬鈴薯種子A、B、C、D進行了栽培實驗，從播種至馬鈴薯塊莖成熟，前后歷時100多天。實驗結(jié)束后，專家們又仔細(xì)測量了馬鈴薯主莖第一花序分支處至地表的高度（株高），芽眼深度（芽眼深度低于1 mm為“淺”，芽眼深度在1～2 mm之間為“較淺”，芽眼深度在2～3 mm之間為“較深”，芽眼深度超過3 mm為“深”），計算了每一根單株結(jié)出的馬鈴薯塊莖數(shù)量，最后還分析、測量了馬鈴薯內(nèi)的干物質(zhì)含量、淀粉含量、還原糖含量與維生素含量。結(jié)果如下。

雜交馬鈴薯種子A：生育期為128 d，株高在83.4～95.8 cm之間，芽眼深度較淺，單株產(chǎn)量在0.45 ～1.23 kg之間，單株結(jié)薯數(shù)在7～11 個之間，干物質(zhì)含量在18.91 %～23.85 %之間，淀粉含量在14.30 %～18.22 %之間，還原糖含量在0.028 %～0.053 %之間，維生素C含量在16.65 ～36.44 mg/100 g之間。

雜交馬鈴薯種子B：生育期為128 d，株高在56.5～82.5 cm之間，芽眼深度較深，單株產(chǎn)量在0.33～0.81 kg之間，單株結(jié)薯數(shù)在4～7個之間，干物質(zhì)含量在17.22 %～21.44 %之間，淀粉含量在13.01 %～16.94 %之間，還原糖含量在0.031 %～0.084 %之間，維生素C含量在14.70 ～15.22 mg/100 g之間。

雜交馬鈴薯種子C：生育期為135 d，株高在73.3～104.7 cm之間，芽眼深度較深，單株產(chǎn)量在0.54 ～0.99 kg之間，單株結(jié)薯數(shù)在6～12個之間，干物質(zhì)含量在16.20 %～19.88 %之間，淀粉含量在11.43 %～14.71 %之間，還原糖含量在0.055 %～0.127 %之間，維生素C含量在7.83 ～15.44 mg/100 g之間。

雜交馬鈴薯種子D：生育期為128 d，株高在86.1～107.7 cm之間，芽眼深度較深，單株產(chǎn)量在0.66 ～1.17 kg之間，單株結(jié)薯數(shù)在4～14個之間，干物質(zhì)含量在21.75 %～25.33 %之間，淀粉含量在17.18 %～18.21 %之間，還原糖含量在0.077 %～0.121 %之間，維生素C含量在7.85 ～27.45 mg/100 g之間。

此次栽培實驗取得了圓滿的成功，這充分說明在馬鈴薯育種中ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以發(fā)揮很大的作用。

3 小結(jié)

作物遺傳育種是一項重要的農(nóng)業(yè)科研工作。搞好作物遺傳育種，有助于保障我國糧食安全，促進我國農(nóng)業(yè)長期可持續(xù)發(fā)展?！狪SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有較高的穩(wěn)定性與多態(tài)性，可以在短時間內(nèi)構(gòu)建作物的基因指紋圖譜。為提升作物遺傳育種的成功率，縮短育種時間，我們應(yīng)當(dāng)積極應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)。

[1]周喜旺,劉鴻燕,王娜,等.小麥種質(zhì)資源BJ399抗條銹病基因的分子標(biāo)記定位[J].麥類作物學(xué)報,2020,40(6):676-681.

[2]盧家仕,韋紹龍,黃素梅,等.基于ISSR分子標(biāo)記的廣西香蕉種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2020,51(4):775-780.

[3]邱國俊,程敏,郭計華. ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物中的應(yīng)用及其研究進展[J].興義民族師范學(xué)院學(xué)報,2020(1):117-120.

[4]戶帥雅,李斌奇,陳孝丑,等.紅掌遺傳多樣性及親緣關(guān)系的ISSR分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報,2020,35(1):20-27.

[5]趙依杰,林麗霞,姚立萍,等.福州地區(qū)柑橘種質(zhì)資源的ISSR分析[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報,2020,10(1):72-76.

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2095-1205(2020)04-65-02

10.3969/j.issn.2095-1205.2020.04.32