豬δ冠狀病毒的研究進(jìn)展

劉嘉琳，劉東旭，趙翠青，李國江

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 吉林132109；3. 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132109)

冠狀病毒(Coronavirus，CoVs)發(fā)現(xiàn)較早，可追溯到1932年，到目前為止，冠狀病毒已經(jīng)演變?yōu)槿蛄餍行圆《荆瑢θ祟惡蛣?dòng)物的生命安全造成極大的威脅。冠狀病毒包括α-冠狀病毒屬、β-冠狀病毒屬、γ-冠狀病毒屬和δ-冠狀病毒屬，目前發(fā)現(xiàn)的豬源冠狀病毒共有5種，豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是繼α冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸道冠狀病毒以及β冠狀病毒屬的豬凝血性腦脊髓炎病毒之后發(fā)現(xiàn)的第5種感染豬的冠狀病毒，PDCoV是在2007年從中國白鼬獾和亞洲豹貓中檢測出的新型病毒，因其與α-冠狀病毒屬和γ-冠狀病毒屬均表現(xiàn)出較高的同源性，因此揭示其可能是新型冠狀病毒。

2012年，Woo等[1]于豬直腸拭子樣本中首次發(fā)現(xiàn)豬δ冠狀病毒并命名為HKU15。2014年2月，在美國俄亥俄州首次于腹瀉仔豬和母豬糞便中檢測到PDCoV后，隨后在美國各州、加拿大、韓國、中國、泰國老撾、越南和菲律賓等地均發(fā)現(xiàn)PDCoV毒株，流行范圍已擴(kuò)散到世界各地，造成養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失[2-5]。

自我國于2012年首次報(bào)道該病毒以來，迄今為止，已在多個(gè)省市檢測到PDCoV的感染[6]。2018年5月14日，發(fā)表在美國《國家科學(xué)院學(xué)報(bào)》上的研究顯示，近年來在多國發(fā)現(xiàn)的“PDCoV”具有在物種間傳播的可能性，但目前尚無人類被感染的報(bào)道[7]。此外，由于冠狀病毒獨(dú)特的基因組復(fù)制策略，PDCoV經(jīng)歷高頻RNA突變和重組，易產(chǎn)生新的變異，這使其極難控制和消除，因此對這種新型病毒應(yīng)予以高度重視，加強(qiáng)對PDCoV的監(jiān)控。

1 PDCoV病原學(xué)特性

1.1 PDCoV形態(tài)及基因組結(jié)構(gòu)

PDCoV屬于套式病毒目(Nidovirales)，冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒亞科(Coronavirinae)，δ冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)，是有囊膜、不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒。在電鏡下觀察，PDCoV病毒粒子呈多形性，直徑約為60～180 nm，有纖突，外膜上有大量棒狀凸起，具有冠狀病毒典型的“皇冠”狀結(jié)構(gòu)。

PDCoV的基因組長度約25.421～26.674 kb，是目前已知冠狀病毒中最小的基因組，其基因結(jié)構(gòu)從5'端到3'端依次為5'非編碼區(qū)(UTR)、開放閱讀框1a/1b(ORF1a/1b)、S基因、E基因、M基因、NS6基因、N基因、NS7基因、3'非編碼區(qū)(UTR)，并且預(yù)測轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(TRS)位于基因組5'末端，具有高度保守的5'-ACCAC-3'核心序列。PDCoV的ORF1a/1b基因序列占基因組全長的2/3，編碼兩個(gè)多聚蛋白pp1a和pp1ab。參考已知的其他冠狀病毒，可以推測pp1a和pp1ab可被重新加工，轉(zhuǎn)變?yōu)榉墙Y(jié)構(gòu)蛋白。NS6基因序列位于M基因序列和N基因序列之間，NS7基因序列與N基因序列為重疊序列，位于N基因的一個(gè)開放閱讀框內(nèi)[8]。

PDCoV編碼至少四種結(jié)構(gòu)蛋白，包括纖突蛋白(Spike，S)、小膜蛋白(Envelope，E)、膜蛋白(Membrane，M)和核衣殼蛋白(Nucleocapsid，N)，以及兩種輔助蛋白NS6和NS7。S蛋白負(fù)責(zé)病毒與細(xì)胞受體結(jié)合后通過膜融合入侵細(xì)胞，并作為誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要抗原。N蛋白高度保守，在病毒RNA衣殼化中起到關(guān)鍵作用，M和E蛋白對病毒體組裝和出芽有重要作用[9]。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)特性

目前對于PDCoV的分離培養(yǎng)，主要采用豬腎細(xì)胞(LLC porcine kidney, LLC-PK)和豬睪丸細(xì)胞(Swine testicular, ST)，并引起明顯的細(xì)胞變圓、增大、皺縮及脫落等細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。目前美國成功分離到的PDCoV USA/IL/2014 和 Michigan/8977/2014 株均是利用ST 細(xì)胞[10]。我國首株分離出的PDCoV NH株采用的是LLC-PK細(xì)胞株[11]。當(dāng)在細(xì)胞單層上接種 PDCoV病毒時(shí)，添加胰蛋白酶、胰液素或無菌豬小腸內(nèi)容物能促進(jìn)病毒在細(xì)胞內(nèi)有效繁殖，但具體機(jī)制還有待研究[12]。

2 PDCoV的致病性與診斷方法

2.1 PDCoV的致病性及臨床診斷

PDCoV可感染各種日齡的豬，對仔豬危害最大，臨床上與豬流行性腹瀉病毒和傳染性胃腸炎的癥狀較為相似，可引起仔豬的精神沉郁、水樣腹瀉、嘔吐及脫水，但程度較輕，有的仔豬表現(xiàn)出輕度間質(zhì)性肺炎。成年豬感染PDCoV后的臨床癥狀與仔豬相比較輕，主要以短暫腹瀉，食欲不振為特征，沒有明顯脫水現(xiàn)象，死亡率較低。感染PDCoV的仔豬死亡率約為30%～40%。

Ma等[8]利用鑒定為PDCoV陽性(Ohio CVM1)的豬糞便及腸內(nèi)容物和細(xì)胞培養(yǎng)毒株MI分別以口服的方式接種到商品化仔豬上，利用熒光定量PCR方法在受感染仔豬的腸道組織、腸內(nèi)容物和糞便中檢測到高水平的病毒RNA，而在血液、肺、肝和腎等器官中檢測到中等水平的病毒RNA，這可能是由病毒血癥導(dǎo)致的，表明PDCoV具有較強(qiáng)的組織嗜性。并且目前美國PDCoV毒株是腸致病性的，感染整個(gè)小腸及大腸的絨毛上皮細(xì)胞，但空腸和回腸是PDCoV復(fù)制的主要部位[11，13]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)剖檢感染PDCoV的豬，可見其胃中充滿凝乳，腸壁變薄，從近端空腸到結(jié)腸呈透明狀，腸腔內(nèi)積聚大量黃色液體，嚴(yán)重者可見胸腺萎縮及胸腔積液。組織病理學(xué)觀察可見胃賁門內(nèi)的胃小凹、胃底大彎、胃竇及小腸上皮細(xì)胞變性壞死，呈急性彌漫性嚴(yán)重萎縮性腸炎，十二指腸、空腸、回腸絨毛嚴(yán)重萎縮，盲腸、結(jié)腸表面上皮細(xì)胞輕度空泡化[3]。

2.2 PDCoV的實(shí)驗(yàn)室診斷方法

PDCoV引起的臨床癥狀與豬流行性腹瀉病毒和傳染性胃腸炎十分相似，肉眼難以分辨確診，因此目前對豬PDCoV的檢測常用方法為病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷。病原學(xué)診斷包括電子顯微鏡技術(shù)(Electron Microscopy，EM)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)、免疫組化技術(shù)(Immunohistochemistry，IHC)及原位雜交技術(shù)(In Situ Hybridization，ISH)等。EM主要是通過鏡下病毒的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)，對病毒鑒別診斷，研究病毒與宿主細(xì)胞之間的關(guān)系。但由于設(shè)備昂貴，技術(shù)需求較高，靈敏度較弱，因此臨床上不能廣泛應(yīng)用，但為病毒分離鑒定提供重要依據(jù)。PCR技術(shù)在目前實(shí)驗(yàn)室病原檢測方法中應(yīng)用最廣泛，目前已成功建立多種針對PDCoV的PCR體系。Marthaler等[15]學(xué)者建立了一步法熒光定量RT-PCR(rRT-PCR)；Jung等[19]建立了對M基因特異的TaqMan定量RT-PCR (qRT-PCR)；Song等[6]以PDCoV N基因?yàn)榘谢蚪⒘薖DCoV nRT-PCR。肖帥等[16]同樣以PDCoVN基因建立了TaqMan定量RT-PCR方法。Sinha等[17]針對M基因的保守區(qū)域建立了病毒特異性實(shí)時(shí)RT-PCR(RT-qPCR)。Zhang等[18]建立了一種對N基因有特異性的單管一步法逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)，用于PDCoV的診斷及檢測，作為一種新興的基因擴(kuò)增技術(shù)，具有靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上應(yīng)用前景廣泛。South Dakota州立大學(xué)已經(jīng)成功獲得PDCoV N蛋白單克隆抗體，可用于免疫熒光試驗(yàn)(Immunofluorescence Assay，IFA)和IHC，其應(yīng)用有利于觀察腸道病變，研究PDCoV的致病性，這種方法精確性較強(qiáng)，但周期較長，不適合用于臨床上的快速檢測[5，10]。ISH屬于分細(xì)胞遺傳學(xué)相關(guān)技術(shù)，該技術(shù)目前已經(jīng)在動(dòng)物基因定位、DNA相關(guān)基因圖譜的構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因的檢測、病毒感染宿主細(xì)胞和產(chǎn)前鑒定等領(lǐng)域中有著廣泛應(yīng)用。Jung等[19]利用ISH確定了PDCoV在哺乳仔豬腸道中的組織嗜性。血清學(xué)診斷包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA)和間接IFA等。Thachil等[20]最早建立了檢測血清中PDCoV特異性IgG抗體的間接ELISA法，目前已報(bào)道的針對PDCoV的間接ELISA 檢測方法還包括Luo等[21]根據(jù)PDCoV的M蛋白、Ma等[8]根據(jù)PDCoV全病毒建立的間接ELISA法，均具有較高的敏感性和特異性。Hu等[12]、Liu等[14]學(xué)者利用間接IFA進(jìn)行了病毒的分離及鑒定。

3 防治措施

PDCoV作為近幾年出現(xiàn)的新型病毒，目前為止，市場上尚無該病毒的商品化疫苗。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，PDCoV經(jīng)常與其它豬腹瀉病毒如PEDV、TGEV及PoRV等交叉感染，但Jung等[19]學(xué)者發(fā)現(xiàn)PDCoV毒株與PEDV和TGEV病毒抗體沒有交叉反應(yīng)性，因此市場上常用的疫苗如豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉-輪狀病毒三聯(lián)弱毒苗和豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒苗等可能對PDCoV并無有效作用。除做好預(yù)防接種，根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r制定科學(xué)合理的免疫程序以外，豬場還應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好消毒工作，保證圈舍干燥衛(wèi)生，保證初生仔豬吃到初乳，增強(qiáng)免疫力，以防止PDCoV的發(fā)生。如有發(fā)病，可參考豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎，遵循“早發(fā)現(xiàn)，早治療”的原則，及時(shí)隔離發(fā)病豬，及時(shí)補(bǔ)液，防止脫水。

4 結(jié) 語

長期以來，腹瀉病一直是養(yǎng)豬行業(yè)的一大威脅。PDCoV的傳播給豬養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失并嚴(yán)重危害豬業(yè)生產(chǎn)安全，引起了人們的廣泛關(guān)注，然而，我們對PDCoV的認(rèn)識還比較匱乏，目前，對PDCoV還有許多問題亟待解決：首先，PDCoV的診斷和檢測工具仍處于發(fā)展階段，這就要求建立快速有效的鑒別診斷技術(shù)；其次，進(jìn)一步開展流行病學(xué)調(diào)查研究，探究其他中間宿主的可能性以及跨種傳播的機(jī)制；第三，目前尚無有效的防治方法，通過明確病源傳播途徑，盡早實(shí)施有效的預(yù)防和監(jiān)控措施。