葛花異黃酮檢驗(yàn)方法研究

宋 笛

（長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033）

1 葛花的藥用價(jià)值

葛花，中藥名又稱葛根花, 屬豆科植物野葛Pueraria lobate（Willd.）Ohwi，也可將其視為甘葛藤Pueraria thomsonii Benth的干燥[1]花蕾。野葛除新疆、西藏外，廣泛分布于全國(guó)各地。甘葛藤則多分布于四川、云南、廣東、廣西等地，常生長(zhǎng)或被栽培于較陰濕的山坡草叢中或灌木叢中。野葛花花冠為藍(lán)紫色或紫色，甘葛藤的花又叫粉葛花，花冠呈紫色或灰紫色，久置過(guò)后變?yōu)辄S白色至深黃色。兩種花均無(wú)臭，味淡，可入藥或作為花草茶飲用。

其功效大致有以下幾種：①解酒護(hù)肝。治療煩熱口渴，頭痛頭暈，飽脹嘔吐，反流酸水等傷酒之癥；②清熱解毒。治療感冒發(fā)熱、小兒腹瀉、急性胃腸炎、突發(fā)性耳聾等疾病；③調(diào)節(jié)內(nèi)分泌。葛花能調(diào)節(jié)人體機(jī)能，增強(qiáng)體質(zhì)，提高機(jī)體抗病能力，抗衰延年；④其他功效。固齒強(qiáng)骨，預(yù)防蛀牙、增強(qiáng)兒童發(fā)育和智力。對(duì)緩解高血壓、冠心病、心絞痛有一定作用。

葛花的這些營(yíng)養(yǎng)保健及藥用價(jià)值，歸功于其富含葛花素、大豆黃酮、花生素、多種氨基酸等成分。而且還含有豐富的銅、硒、鈣、鐵、銅、硒等礦物質(zhì)。作為一種藥食同源的植物，很早便在《神農(nóng)本草經(jīng)》《千金方》《本草綱目》中有所記載。

2 葛花的研究現(xiàn)狀

隨著葛根功效被熟知，許多專業(yè)從事葛根栽培和葛根產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的公司如雨后春筍般出現(xiàn)。粉用葛根的品種選育、種植基地、食品加工方面的進(jìn)步，帶動(dòng)了葛根及葛花的藥理研究、成分提取、新藥開(kāi)發(fā)。隨著葛花中越來(lái)越多的化學(xué)成分被檢出，其新的藥理活性領(lǐng)域也在不斷擴(kuò)大。根據(jù)現(xiàn)代研究結(jié)果可知，葛根內(nèi)部含有量最大的物質(zhì)為黃酮類化合物，其余物質(zhì)包括揮發(fā)油、皂苷、甾醇、揮發(fā)油、氨基酸，其中黃酮類化合物在葛根葛花中表現(xiàn)突出，如鳶尾苷（tectoridin）、尼泊爾鳶尾素（irisolidone）、鳶尾黃素（tectorigenin）、6'-O- 木 糖 鳶 尾 苷（6'-O-xylo -syl -tectoridin)；刺槐素（robinin）、芒柄花素（formomonetin）、染料木素（genistein)、黃豆黃素（glycitein）、大豆黃素（daidzein)、槲皮素（quercetin)；葛花亭（kakkatin）、蘆?。╮utin）、葛花苷（kakkalide）、鷹嘴豆素甲（biocanin A）、芒柄花苷（ononin）、煙花苷（nicotiflorin）、黃豆黃苷（glycitin）、6'-O- 木糖黃豆苷（6'-O-xylosy -glycitin）[2]。

其中，葛花苷和鳶尾苷在葛花中的含量較高，是葛花異黃酮的代表性成分[3]。張淑萍等[4]采用反相高效液相色譜法測(cè)定了葛花中3 種異黃酮（葛花苷、次葛花苷和尼泊爾鳶尾異黃酮三種異黃酮）的含量，分別為3.33%、0.22%和0.32%。

目前，葛花異黃酮的提取工藝常見(jiàn)于文獻(xiàn)的有色譜法、溶液法等。

2.1 色譜法

尹俊亭[5-6]在葛花提取物分離、純化、重結(jié)晶操作使用了硅膠柱色譜，分離結(jié)果可知，葛花可提取出尼泊爾鳶尾異黃酮7-O-β-D- 葡萄糖苷、染料木苷（genistin）等物質(zhì)。張淑萍等[7]使用色譜、光譜、理化相結(jié)合的方法對(duì)葛花進(jìn)行分離提取，得到了刺芒柄花素（formononetin）、尼泊爾鳶尾異黃酮、大豆苷元、8- C- 芹菜糖塘（1→6）- 葡萄糖- 大豆苷等物質(zhì)。裴香萍[8]是第一位使用聚酰胺柱色譜法提取出葛花醇提物內(nèi)7- 甲氧基香豆素的學(xué)者。張杰等[9]曾使用羥丙基葡聚糖凝膠及硅膠色譜柱方法對(duì)葛花進(jìn)行了分離提取，第一次從葛花中獲取了5，6，7，4'- 四羥基異黃酮- 6，7- 二葡萄糖苷物質(zhì)。

2.2 溶液法

葛花提取物提取最常用的溶劑為乙醇，在提取過(guò)程中浸提時(shí)間、浸提溫度、固液比、乙醇濃度、回流時(shí)間等因素[10]對(duì)葛花異黃酮提取率有很大的影響[11-12]。

為了優(yōu)化異黃酮的提取工藝，張永丹[13]、馮維希[14]等使用正丁醇/水體系，王瑤[15]等使用乙醇/乙酸乙酯體系，提取葛花中的異黃酮，并發(fā)現(xiàn)選用乙醇溶液提取的產(chǎn)率有所提高。吳桐等以乙酸乙酯/乙醇/水（體積比為4.0∶0.5∶3.0）組成三元溶劑體系，從葛根粗提物200 mg 中提取葛根素2.36 mg，鳶尾苷8.57 mg，染料木黃酮5.34 mg，經(jīng)高效液相色譜分析其純度均達(dá)到90.0%以上，為葛花中異黃酮類活性化合物的分離純化提供了新途徑[16]。

其他試劑如水、甲醇[17]等，也在文獻(xiàn)中有記錄過(guò)。汪新亮提出，以甲醇為溶劑的索氏提取儀提取和熱水浸提相結(jié)合的提取方法提取的葛花總異黃酮和鳶尾異黃酮產(chǎn)量均為最高,鳶尾異黃酮破壞較少。甲醇中索氏提取儀提取和水浸提相結(jié)合的提取方法為葛花中鳶尾異黃酮最佳提取方法[18]。

2.3 其他輔助方式

隨著現(xiàn)代儀器的發(fā)展，超聲波促融[19-20]越來(lái)越多地應(yīng)用到葛花黃酮提取的工藝流程中。代明君用超聲波技術(shù)促進(jìn)葛花異黃酮的提取，發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)葛花黃酮得率的影響程度為料液比>乙醇濃度>超聲功率>超聲時(shí)間。在此基礎(chǔ)上，他用高壓脈沖電場(chǎng)法提取葛花黃酮，在乙醇濃度60%，料液比1∶32，電場(chǎng)強(qiáng)度16 kv/cm，脈沖數(shù)8 個(gè)，此時(shí)黃酮得率為10.37%，得率高于超聲波法提取葛花黃酮[21]。

3 檢驗(yàn)方法

目前，葛花提取物分離的常規(guī)檢驗(yàn)方法如UV 法、可見(jiàn)分光光度法及HPLC 法多見(jiàn)于文獻(xiàn)。

3.1 UV 法（中國(guó)藥典2005 年版I 部，附錄VA）[22]

3.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取20.8 mg 鳶尾苷對(duì)照品，于60℃干燥至恒重，加入乙醇制成208 μg/mL 的溶液作為對(duì)照品溶液。

3.1.2 供樣品溶液的制備

取過(guò)3 號(hào)篩且干燥至恒重的葛花藥材粉末約0.3 g，精密稱定，置100 mL 帶塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，關(guān)合，稱重，加熱回流提取2 h，冷卻，再次稱重，用60%乙醇補(bǔ)減量，搖勻，過(guò)濾，精密吸取濾液0.1 mL，放入10 mL 容量瓶?jī)?nèi)加入乙醇至標(biāo)準(zhǔn)刻度，最后搖勻既可。

3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取對(duì)照品溶液0.25 mL，0.5 mL，0.75 mL，1.0 mL，1.25 mL 分別于25 mL 量瓶中，加60%乙醇至刻度?？瞻兹芤簽橐掖既芤海^察波長(zhǎng)狀況，達(dá)到265 波長(zhǎng)后對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果設(shè)吸光度、濃度分別為縱橫乙醇溶液為空白，在265 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)、繪坐標(biāo)可得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.1.4 測(cè)定法

依照供樣品溶液照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法, 對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線可知樣品溶液內(nèi)鳶尾苷質(zhì)量（μg），計(jì)算結(jié)果，即得。

3.2 可見(jiàn)分光光度法[23]

對(duì)照品溶液和供樣品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取適量蘆丁，溶于80%乙醇中，制成12.32 μg/mL 的對(duì)照溶液。

葛根用去離子水漂洗3 次，60℃干燥后壓碎，準(zhǔn)確稱取葛根花藥粉2 g，放入索氏提取液中，用乙醚脫脂2 h 至提取物無(wú)色，蒸干乙醚，殘?jiān)?5%乙醇浸泡5 h，索氏提取4 h，直至提取物無(wú)色。濾液用95%乙醇在50 mL 容量瓶中稀釋，以制備供樣品溶液。

總黃酮測(cè)定方法。精密吸取供樣品溶液適量，置于10 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min，加入10% Al（NO3）2。溶 液0.30mL，搖 勻，再 放 置6 min，加 入4 %NaOH 4.00 mL，加蒸餾水稀釋至10.00 mL，搖勻，放置10 min，同法做空白，于506 nm 處測(cè)定吸光度。

3.3 HPLC 法[24]

稱取50 mg 葛花提取物、12.5 mg 的純化物，使用80%甲醇通過(guò)超聲溶解方式置入容量瓶，定容50 mL，搖晃均勻讓微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，可取得10μL 續(xù)濾液，后將續(xù)濾液注入高效液相色譜儀內(nèi)進(jìn)行分析。隨后在高效液相色譜儀分析過(guò)程中，對(duì)峰面積進(jìn)行記錄，采用外標(biāo)法對(duì)葛花提取物內(nèi)鳶尾苷、6"-O- 木糖鳶尾、染料木素含量進(jìn)行計(jì)算，最后將計(jì)算結(jié)果與鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)品峰面積進(jìn)行百分比計(jì)算既可。

4 小結(jié)

（1）高效液相色譜與紫外分光光度法聯(lián)合可用于葛根的質(zhì)量評(píng)價(jià)和提取工藝的確定。兩種方法綜合評(píng)價(jià)最佳提取工藝,其結(jié)果更為科學(xué)合理。

（2）鳶尾苷、6"-O- 木糖鳶尾苷、染料木素3 種主要黃酮類成分的含量,可作為葛花質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)物質(zhì)。

（3）隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，一些精密檢驗(yàn)方法，如超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/Ms）也可以應(yīng)用到葛花提取物分離中[25]。