紫外-可見分光光度法測定可溶微針貼片中羅丹明B的含量

劉春艷，柏沫含，徐雨靚，萬天妍，陳佳琪，王清清，馬 濤

可溶微針作為新型經(jīng)皮給藥制劑，可以有效突破皮膚角質(zhì)層屏障，解決經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)遞藥效率低的瓶頸問題，實現(xiàn)近似于注射給藥的治療效果[1-2]；同時可完全溶解的微米級的針部又使其具有無痛、微創(chuàng)、便于病人自主給藥、無廢棄針頭二次危害等諸多優(yōu)點(diǎn)[3]。因此，近年來，可溶微針成為新型遞藥系統(tǒng)研究的主要方向之一，具有極大的臨床應(yīng)用前景。但是，該種給藥方式藥物在體內(nèi)的分布、代謝、消除情況及其與皮下注射的區(qū)別等尚缺乏相應(yīng)的研究。

本課題組以透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)和聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP K90)作為制針輔料，包載可溶性藥物，用兩步注模干燥法制備出可溶微針貼片，進(jìn)行大鼠體內(nèi)給藥研究。為了更深入地研究可溶微針經(jīng)皮給藥的藥物體內(nèi)過程，直觀、實時、動態(tài)地比較皮下注射與可溶微針兩種方式給藥后，藥物在動物體內(nèi)的分布情況，具有實時觀測記錄熒光染料體內(nèi)分布的小動物活體成像實驗是優(yōu)選的方法。羅丹明B是一類人工合成的以氧雜蒽作為母體的熒光染料，可溶于水，并具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性和較高的量子產(chǎn)率，廣泛應(yīng)用于信息科學(xué)、激光染料、環(huán)境化學(xué)、生物醫(yī)藥科學(xué)和分析化學(xué)等領(lǐng)域[4-5]，符合可溶微針的載藥特點(diǎn)，可作為本研究的模型藥物進(jìn)行在體給藥和活體成像實驗。

為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確，需要建立一種快速、便捷、準(zhǔn)確的檢測方法，不僅能排除可溶微針輔料的干擾，還能夠準(zhǔn)確檢測出可溶微針中羅丹明B的載藥量。本研究旨在采用紫外-可見分光光度法建立一種準(zhǔn)確可靠的可溶微針貼片中羅丹明B的含量分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；FA2204N型電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；Advantage A10純水儀(Milli-Q公司)。

1.2 試藥 可溶微針貼片(自制)；羅丹明B(上海圻明生物科技有限公司)；HA(華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，批號:1806151)；PVP K90(德國BASF，批號：L96014768E0)；水為超純水。

1.3 溶液的配制

1.3.1 羅丹明B貯備液的配制 精密稱取羅丹明B固體粉末0.005 2 g，置于100 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度線，配制濃度為52 μg/mL的羅丹明B貯備液。

1.3.2 制針輔料溶液的配制 分別精密稱取HA、PVP K90各0.025 0 g，置于50 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度線，配制濃度為 0.5 mg/mL的制針輔料貯備液。

1.3.3 可溶微針貼片水溶液的制備 用手術(shù)刀片對已制備好的可溶微針貼片進(jìn)行針部與基層分離，取針部溶解于1 mL 超純水中即得[6]。

1.4 檢測波長與專屬性試驗 取1.3項下的羅丹明B、HA、PVP K90貯備液以及可溶微針貼片水溶液，以超純水為空白試劑分別稀釋成適宜濃度水溶液，并于200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，得到其紫外光譜圖。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取1.3.1項下羅丹明B貯備液稀釋成濃度為10.4 μg/mL的水溶液，再精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，以超純水定容，得到濃度為1.04、2.08、3.12、4.16、5.20、6.24、7.28、8.32、9.36、10.4 μg/mL的羅丹明B系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別測量其在554 nm處的吸光度，以吸光度(Y)對羅丹明B濃度(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 精密度試驗 取1.3.1項下羅丹明B貯備液稀釋到濃度為5.20 μg/mL羅丹明B溶液，在554 nm處連續(xù)測定6次，計算日內(nèi)精密度，3 d 內(nèi)每天同法測定，計算日間精密度。

1.7 重復(fù)性試驗 取實驗室自制的同一批可溶微針貼片6片，分別用手術(shù)刀片將針部與基層分離，取針部分別置于1 mL 超純水中，振搖時其完全溶解，測量其在554 nm處的吸光度，計算每片可溶微針貼片針部的羅丹明B含量。

1.8 加樣回收率試驗 精密稱取0.005 0 g羅丹明B于100 mL容量瓶中得到濃度為50 μg/mL的羅丹明B溶液，取1.3.2項下的制針輔料溶液，按照羅丹明B與混合輔料的濃度比為1∶40、1∶20、1∶10配制藥物輔料混合溶液。其中混合輔料濃度保持不變，總濃度為100 μg/mL，各輔料均為50 μg/mL。羅丹明B濃度分別為2.5、5.0、10.0 μg/mL。將混合溶液在544 nm處測量吸光度，并通過線性方程計算相應(yīng)的濃度。

1.9 穩(wěn)定性試驗 取可溶微針貼片溶液，分別于 0、0.5、1、2、4、6、12、24 h 進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 檢測波長與專屬性試驗 羅丹明B在259、284、355、400、554 nm處均有吸收，其中，在554 nm處吸收最大，且空白試劑無干擾，而各制針輔料在554 nm處沒有吸收，表明制針輔料對羅丹明B含量測定無干擾。選擇554 nm作為羅丹明B的檢測波長，結(jié)果見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以吸光度(Y)對羅丹明B濃度(X)進(jìn)行線性回歸，線性回歸方程為Y=0.064 9X+ 0.003 3(r=0.999 5)，羅丹明B濃度在1.04～10.40 μg/mL范圍內(nèi)，與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗 在554 nm測定5.20 μg/mL羅丹明B溶液，日內(nèi)精密度為1.04%(見表1)，日間精密度為1.51%(見表2)。

表1 紫外-可見分光光度法測定羅丹明B日內(nèi)精密度結(jié)果(n=3)

表2 紫外-可見分光光度法測定羅丹明B日間精密度結(jié)果(n=3)

2.4 加樣回收率試驗 2.5、5.0、10.0 μg/mL的羅丹明B回收率分別為95.96%、97.13%、97.87%，RSD分別為0.32%、0.16%、0.21%(見表3)。

表3 紫外-可見分光光度法測定羅丹明B加樣回收率結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗 6片可溶微針貼片中羅丹明B含量為83.8、81.0、81.3、83.4、82.2、83.6 mg，RSD為1.48%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 24 h內(nèi)測定羅丹明B吸光度的RSD值為2.13%(n=8)。

3 討論

羅丹明B在水溶液中具有強(qiáng)烈的熒光，本研究前期采用熒光分光光度法檢測羅丹明B的含量，但發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)烈的熒光淬滅現(xiàn)象，羅丹明B濃度愈高，則淬滅愈嚴(yán)重，這可能是因為高濃度羅丹明B體系中存在自熄滅作用，引起淬滅的因素較多，這可能會導(dǎo)致微針貼片中羅丹明B的含量測定不準(zhǔn)確。此外，采用熒光分光光度法測定羅丹明B系列標(biāo)準(zhǔn)溶液時，發(fā)現(xiàn)隨著羅丹明B濃度增大，發(fā)射波長出現(xiàn)紅移現(xiàn)象?；谝陨显?，本研究最終未采用熒光分光光度法，選擇紫外-可見分光光度法測量可溶微針貼片中羅丹明B的含量。

目前羅丹明B的測定方法多采用高效液相色譜法，而紫外可見分光光度法相對高效液相色譜法測定羅丹明B具有簡便快捷的優(yōu)勢。羅丹明B是一種熒光物質(zhì)，可以通過小動物成像系統(tǒng)進(jìn)行實時檢測，為了探討可溶微針制劑是否具有緩釋作用，我們以羅丹明B溶液作為對照組，羅丹明B可溶微針作為實驗組，建立紫外-可見分光光度法對可溶微針中羅丹明B進(jìn)行定量，從而保證兩個組別的羅丹明B含量相等，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)的實驗研究。