lncRNA TUG1調(diào)控miRNA-145促進結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

陳 宋，姜從橋

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤之一，在我國結(jié)腸癌的發(fā)病率位于惡性腫瘤的第3位，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。研究[2]證實，長鏈非編碼RNA(long chain non-coding RNA，lncRNA)參與組織的癌變、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞的增殖等過程。lncRNA?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)在多種腫瘤中高表達(dá)，并促進腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。lncRNA與miRNA均屬于非編碼RNA，它們在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用已得到普遍認(rèn)可[4]。miRNA-145具有阻止細(xì)胞癌變和抑制癌細(xì)胞生長等作用，miRNA-145表達(dá)的變化對腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、凋亡等均有一定影響，有研究[5]發(fā)現(xiàn)，增強miRNA-145表達(dá)則可降低 HCT116細(xì)胞增殖、侵襲活性和增加腫瘤細(xì)胞凋亡。但目前TUG1對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響以及是否與靶向miRNA-145有關(guān)，尚未見報道。因此，本研究探討lncRNA TUG1和miRNA-145對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116及人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞株NCM460(購自美國ATCC)、胎牛血清(美國Gibco公司)、TRIzol、miRNA-145、U6引物(美國Invitrogen公司)、TUG1、GAPDH普通PCR上下游引物(上海生工公司)、SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)、DEPC(美國 Sigma)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo Scientific)、MTT試劑(北京索萊寶生物科技有限公司)、結(jié)晶紫染色液(北京華越洋生物科技有限公司)、熒光素酶活性檢測試劑盒(美國GeneCopoeia公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 根據(jù)處理方法不同將結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116分為6組，分為TUG1 siRNA陰性對照組(si-con組)、TUG1 siRNA組、miRNA-145陰性對照組(miRNA NC組)、miRNA-145 mimic組、si-TUG1+miRNA NC組和TUG1 siRNA+miRNA-145 inhibitor組。si-con組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染TUG1 siRNA陰性對照；TUG1 siRNA組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染TUG1 siRNA；miRNA-145陰性對照組(miRNA NC組)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-145陰性對照；miRNA-145 mimic組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-145模擬物；si-TUG1+miRNA NC組：細(xì)胞共轉(zhuǎn)染TUG1 siRNA和miRNA-145陰性對照；TUG1 siRNA+miRNA-145 inhibitor組：細(xì)胞共轉(zhuǎn)染TUG1 siRNA和miRNA-145抑制劑。分別于轉(zhuǎn)染后收集各組細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測HCT116細(xì)胞中TUG1及miRNA-145的表達(dá)水平 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，TUG1以GAPDH為內(nèi)參，miRNA-145以U6為內(nèi)參，采用qRT-PCR檢測各組細(xì)胞TUG1基因及miRNA-145的表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照說明書。每組TUG1及miRNA-145基因的相對表達(dá)量按2-△△Ct法計算(見表1)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CTUG1與miRNA-145的靶向關(guān)系 將熒光素酶報告載體TUG1-野生型(WT)、TUG1-突變型(MUT)分別與miRNA-145 mimics、miRNA-NC用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，培養(yǎng)5 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作步驟進行操作。結(jié)果以海參熒光素酶的發(fā)光強度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強度的比值反映miRNA-145與TUG1的結(jié)合力。

1.2.5 MTT法檢測HCT116細(xì)胞的增殖情況 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，以1×104個/孔的比例接種到96孔板中，然后培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μL濃度為5% MTT試劑，正常培養(yǎng)4～6 h后將培養(yǎng)孔中上清液吸除，每孔加入100 μL二甲基亞砜，自由光照10 min。用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實驗檢測HCT116細(xì)胞的遷移能力 將各組細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，等細(xì)胞融合后用200 μL高壓滅菌槍頭在孔內(nèi)輕輕劃1～3道痕，劃痕后和24 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕修復(fù)情況，顯微鏡觀察并統(tǒng)計劃痕的間隙距離。

1.2.7 Transwell 細(xì)胞侵襲實驗檢測HCT116細(xì)胞的侵襲能力 將過夜水化的Matrigel基質(zhì)膠按1∶4比例稀釋，取40 μL加入預(yù)冷的Transwell小室，置于37 ℃培養(yǎng)30 min。用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸至5×105/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入上室，下室加入含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基700 μL，于37 ℃培養(yǎng)24 h。將膜下面的細(xì)胞與1%多聚甲醛混合，用體積分?jǐn)?shù)為0.2%結(jié)晶紫溶液染色15 min。用顯微鏡計數(shù)進入膜下的細(xì)胞數(shù)，隨機取10個視野，計算平均值。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HCT116細(xì)胞中TUG1及miRNA-145表達(dá)水平 與人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞株NCM460相比，結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中TUG1相對表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)，miRNA-145相對表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)(見表2)。

表2 HCT116細(xì)胞中TUG1及miRNA-145表達(dá)水平

2.2 lncRNA TUG1與miRNA-145的靶向關(guān)系 運用miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miRNA-145與TUG1 3′-UTR存在結(jié)合位點(見圖1)；雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，與miRNA NC組相比，miRNA-145組wt-TUG1細(xì)胞中熒光素酶活性降低(P<0.05)，mut-TUG1細(xì)胞中熒光素酶活性不受影響(P>0.05)(見表3)。

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.3 抑制TUG1的表達(dá)對HCT116細(xì)胞增殖及遷移、侵襲能力的影響 與si-con組相比，TUG1 siRNA組HCT116細(xì)胞中TUG1表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，HCT116細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)，細(xì)胞劃痕相對寬度明顯增寬，細(xì)胞侵襲數(shù)明顯減少(P<0.01)(見表4)。

表4 抑制TUG1的表達(dá)對HCT116細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響

2.4 過表達(dá)miRNA-145對HCT116細(xì)胞增殖水平及遷移、侵襲能力的影響 與miRNA NC組相比，miRNA-145 mimic組HCT116細(xì)胞中miRNA-145表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，HCT116細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)，細(xì)胞劃痕相對寬度明顯增寬，細(xì)胞侵襲數(shù)明顯減少(P<0.01)(見表5)。

表5 過表達(dá)miRNA-145對HCT116細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響

2.5 沉默TUG1表達(dá)和抑制miRNA-145表達(dá)對HCT116細(xì)胞增殖水平及遷移、侵襲的影響 與si-con組相比，TUG1 siRNA組HCT116細(xì)胞中miRNA-145表達(dá)水平升高(P<0.05)；與si-TUG1+miRNA NC組相比，TUG1 siRNA+miRNA-145 inhibitor組HCT116細(xì)胞中miRNA-145表達(dá)水平降低(P<0.05)；HCT116細(xì)胞增殖活性增強，細(xì)胞劃痕相對寬度減小，細(xì)胞侵襲數(shù)目增加(P<0.05)(見表6)。

表6 各組HCT116細(xì)胞miRNA-145表達(dá)水平及增殖、侵襲、遷移能力的比較

3 討論

TUG1已被證明與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在大部分惡性腫瘤中呈異常上調(diào)表達(dá)，發(fā)揮促癌因子的作用[6]。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，TUG1在多種卵巢癌細(xì)胞系中高表達(dá)，干擾TUG1表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移能力顯著下降，其機制可能與干擾TUG1表達(dá)后細(xì)胞能量代謝下降有關(guān)。另有研究[8]發(fā)現(xiàn)，TUG1可以通過EMT途徑提高胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞株NCM460相比，結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中TUG1相對表達(dá)水平均明顯升高；與si-con組相比，TUG1 siRNA組HCT116細(xì)胞中TUG1表達(dá)水平顯著降低；HCT116細(xì)胞增殖活性降低，劃痕相對寬度顯著增加，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少，提示抑制TUG1的表達(dá)可抑制HCT116細(xì)胞增殖水平及遷移、侵襲能力。

miRNA在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，有研究[9]表明，miRNA-145低表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，過表達(dá)miRNA-145能夠抑制卵巢癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲。另有研究[10]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miRNA-145能夠降低肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的遷移、侵襲的能力，miRNA-145可能成為未來肺癌生物治療的新靶點。本研究對比人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞株NCM460與結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCT116細(xì)胞中miRNA-145相對表達(dá)水平明顯降低；過表達(dá)miRNA-145后，與miRNA NC組相比，miRNA-145 mimic組HCT116細(xì)胞中miRNA-145表達(dá)水平顯著升高；HCT116細(xì)胞增殖活性降低，劃痕相對寬度顯著增加，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少，提示過表達(dá)miRNA-145可抑制HCT116細(xì)胞增殖水平及遷移、侵襲能力。

lncRNA可以通過與靶基因mRNA競爭性結(jié)合miRNA的應(yīng)答元件，從而抑制miRNA的表達(dá)，間接增高靶基因的表達(dá)水平[11]。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA FoxD2-AS1表達(dá)上調(diào)，miR-324-5p表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)oxD2-AS1通過靶向負(fù)調(diào)控miR-324-5p的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。另有研究[13]發(fā)現(xiàn)，HOTAIR與miR-101直接相互作用，miR-101可以直接與lncRNA HOTAIR結(jié)合位點結(jié)合并影響熒光素酶活性，lncRNA HOTAIR通過調(diào)控miR-101的表達(dá)促進食管癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的發(fā)生。本研究采用雙熒光素酶活性檢測TUG1與miRNA-145的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示miRNA-145與TUG1 3′-UTR存在結(jié)合位點，與si-con組相比，TUG1 siRNA組HCT116細(xì)胞中miRNA-145表達(dá)水平升高；在HCT116細(xì)胞中沉默TUG1表達(dá)并抑制miRNA-145表達(dá)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與si-TUG1+miRNA NC組相比，TUG1 siRNA+miRNA-145 inhibitor組HCT116細(xì)胞中miRNA-145表達(dá)水平降低；HCT116細(xì)胞增殖活性增強,劃痕相對寬度減小,細(xì)胞侵襲數(shù)目增加，提示TUG1對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用可能是通過靶向抑制miRNA-145的表達(dá)實現(xiàn)的。

綜上所述，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中TUG1表達(dá)上調(diào)，miRNA-145表達(dá)下調(diào)，干擾TUG1表達(dá)可通過靶向上調(diào)miRNA-145的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為TUG1和miRNA-145在結(jié)腸癌診斷、治療及預(yù)后提供了實驗依據(jù)。