蘆丁減輕全氟辛酸暴露致小鼠心肌損傷的作用研究

程靜靜，余麗麗，周勇兵，湯雨婷，馬雨妍，吳俊英，劉 輝

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)屬于全氟類化合物，是全氟烷酸的重要代表物，其不僅具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，還能耐光解、水解及微生物降解，基于此類特性PFOA被大量應(yīng)用于食品包裝、水源、紡織中，從而造成了廣泛的環(huán)境污染，并為進(jìn)入機(jī)體提供了條件；而飲食是攝入PFOA的主要途徑，PFOA在機(jī)體中難被代謝排出[1-2]。研究[3-4]報(bào)道，在動(dòng)物組織與人體血清中均能檢測(cè)到PFOA，PFOA暴露會(huì)造成肝臟、心臟、腎臟、免疫、生殖及甲狀腺等大量臟器系統(tǒng)侵損，是具有全身多臟器毒性作用的化合物。在心血管方面，PFOA可降低成年豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間與峰值，此外可使膜電位改變異常，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流加快細(xì)胞中Ca2+負(fù)荷從而發(fā)生心肌細(xì)胞損傷[5-6]。還有研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，PFOA暴露在心臟中造成的心肌細(xì)胞損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，PFOA暴露易增加活性氧釋放，促進(jìn)細(xì)胞DNA氧化加重心肌損傷程度。因此，目前應(yīng)確定安全、有效藥物用于預(yù)防PFOA引起的心肌損傷，顯得尤為重要。

蘆丁是一種生物活性豐富的黃酮類化合物，具有預(yù)防心肌缺血、心律失常，調(diào)節(jié)血清膽固醇等作用。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)蘆丁可緩解5-羥色胺所致的血管損傷并保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)還有抗炎癥、抗化學(xué)性肝損傷的作用，但蘆丁對(duì)PFOA造成的小鼠心肌損傷保護(hù)作用尚不明確。本研究探討蘆丁對(duì)PFOA誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷的保護(hù)機(jī)制，為開發(fā)預(yù)防PFOA毒性作用心肌損傷的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 蘆丁(純度≥98%，153-18-4，北京百靈威科技有限公司)；PFOA(純度≥98%，335-67-1，Sigma-Aldrich)；乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒(微孔法)(A020-2，南京建成生物工程研究所)；總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒(單試劑GPO-PAP法)(A111-1-1，南京建成生物工程研究所)；三酰甘油(TG)測(cè)定試劑盒(單試劑GPO-PAP法)(A110-1-1，南京建成生物工程研究所)；還原型谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒(微板法)(A006-2，南京建成生物工程研究所)；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)定試劑盒(羥胺法)(A001-1，南京建成生物工程研究所)。酶標(biāo)儀(Synergy2，美國(guó)伯騰儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性ICR小鼠24只，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2013-0006。飼養(yǎng)于小鼠動(dòng)物房適應(yīng)性1周，經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，飼養(yǎng)溫度(21±2)℃，相對(duì)濕度為50%～70%，光周期為每天12 h光照、12 h黑暗，小鼠自由取食，自由飲去離子水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與心肌損傷造模 適應(yīng)性1周后將24只ICR小鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，即對(duì)照組、PFOA組、PFOA+蘆丁組。

對(duì)照組：在實(shí)驗(yàn)14 d內(nèi)每日灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)14 d；PFOA組：在實(shí)驗(yàn)14 d內(nèi)每天早上9點(diǎn)稱重后，按體質(zhì)量進(jìn)行5 mg·kg-1·d-1PFOA灌胃，PFOA暴露濃度設(shè)計(jì)參考WANG等[9]研究，連續(xù)14 d；PFOA+蘆丁組：在實(shí)驗(yàn)14 d內(nèi)每天早上9點(diǎn)稱重5 mg/kg PFOA進(jìn)行灌胃，每天下午3點(diǎn)160 mg·kg-1·d-1蘆丁灌胃前攪拌水浴加熱37 ℃后灌胃，蘆丁濃度設(shè)計(jì)參考儲(chǔ)金秀等[10]研究，連續(xù)14 d。期間每天記錄小鼠體質(zhì)量與生命體征，稱量體質(zhì)量與灌胃時(shí)間為固定在每天的相同時(shí)間點(diǎn)，每日1次，連續(xù)14 d。

1.3.2 標(biāo)本制備 在14 d時(shí)，眼眶后靜脈叢采集血液1 mL，并處死小鼠，血液經(jīng)3 000 r/min、4 ℃離心15 min制備血清，并存放于-80 ℃待測(cè)。立即迅速取出心臟組織，去除右心耳心房及大血管，用等體積0.9%氯化鈉溶液清洗，濾紙充分將水分吸干后稱重，然后取一部分存放于-80 ℃環(huán)境中備用；取一部分心肌組織固定于甲醛溶液中。隨機(jī)挑選5只小鼠進(jìn)行生化及酶活檢測(cè)，余下3只小鼠進(jìn)行HE切片染色。

1.3.3 血清LDH活性檢測(cè) 采用微板法測(cè)定小鼠血清LDH活性。

1.3.4 心肌TG、TC含量檢測(cè) 取待測(cè)心臟組織5 cm3，采用高速組織研磨儀(Servicebio，KZ-Ⅱ)將組織和0.9%氯化鈉溶液混合制作成10%心肌組織勻漿，各取0.5 mL 10%勻漿加0.9%氯化鈉溶液4.5 mL制備1%勻漿，采用FD酶法測(cè)定TG、TC含量，按照測(cè)試盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作，采用酶標(biāo)儀讀取光密度值。

1.3.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)變化檢測(cè) 取待測(cè)心臟組織5 cm3，采用高速組織研磨儀將組織和0.9%氯化鈉溶液混合制作成10%心肌組織勻漿，各取0.5 mL 10%勻漿加0.9%氯化鈉溶液4.5 mL制備1%勻漿。采用組織硫代巴比妥酸法檢測(cè)丙二醛(MDA)含量、微板法法檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活性、羥胺法檢測(cè)T-SOD活性，以上觀察指標(biāo)均嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3.6 小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)觀察 將固定于甲醛溶液中的心臟組織石蠟包埋切片、厚度約4 μm，經(jīng)脫蠟、乙醇脫水后，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片，將封片放在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織并拍照。

1.3.7 心臟體質(zhì)量比計(jì)算公式 心臟體質(zhì)量比=小鼠心臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 蘆丁干預(yù)PFOA暴露14 d小鼠體質(zhì)量和心臟質(zhì)量比較 各組小鼠體質(zhì)量1～2 d比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3～14 d各組小鼠體質(zhì)量有差異，且PFOA組小鼠體質(zhì)量低于PFOA+蘆丁組(P<0.05)；PFOA組和PFOA+蘆丁組小鼠干預(yù)14 d心臟質(zhì)量低于對(duì)照組，而PFOA+蘆丁組高于PFOA組(P<0.05)；3組小鼠14 d心臟體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 蘆丁干預(yù)PFOA暴露14 d小鼠心肌TG、TC含量和血清LDH活性 PFOA+蘆丁組小鼠14 d心肌血清LDH活性低于PFOA組(P<0.05)；而PFOA組與PFOA+蘆丁組小鼠14 d心肌TG、TC含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 蘆丁干預(yù)PFOA暴露14 d小鼠心肌TG、TC含量和血清LDH活性

2.3 蘆丁干預(yù)PFOA暴露14 d小鼠心肌MDA含量、GSH-PX和T-SOD 活性 PFOA組小鼠14 d心肌MDA含量高于對(duì)照組(P<0.05)，而PFOA組與對(duì)照組小鼠14 d心肌T-SOD、GSH-PX活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PFOA+蘆丁組小鼠14 d心肌MDA含量低于PFOA組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PFOA+蘆丁組與PFOA組在小鼠14 d時(shí)心肌T-SOD活性上差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。

表3 蘆丁干預(yù)PFOA暴露14 d小鼠心肌MDA含量、GSH-PX和T-SOD活性

2.4 蘆丁干預(yù)PFOA暴露14 d小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞并未見萎縮或肥大；PFOA組小鼠表現(xiàn)出不同程度心肌細(xì)胞表現(xiàn)出肥大、壞死，心肌纖維扭曲、橫紋模糊；如圖中黑色箭頭所示，PFOA處理組，部分心肌細(xì)胞胞核明顯偏向細(xì)胞邊緣。PFOA+蘆丁組排列較為整齊，質(zhì)內(nèi)間觀察到少量膠原纖維增生胞質(zhì)，部分心肌細(xì)胞表現(xiàn)出心肌纖維扭曲輕微(見圖1)。

3 討論

全氟烷酸屬于一類人工合成化合物，在國(guó)民生產(chǎn)及生活中都具有重要作用，但由于其廣泛的使用，現(xiàn)已造成了持久性的環(huán)境污染，在人與動(dòng)物健康方面也造成了很多影響[10]。PFOA是這類化合物的重要代表，它嚴(yán)重影響機(jī)體代謝穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體活性在心肌損傷中發(fā)揮毒性作用[11]。研究[12]報(bào)道，PFOA暴露易造成的心肌損傷常表現(xiàn)在小鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量及心肌組織形態(tài)學(xué)變化等方面。在本研究中，從體質(zhì)量、心臟質(zhì)量觀察到，PFOA組小鼠體質(zhì)量下降、心臟質(zhì)量增加，而從組織病理學(xué)中發(fā)現(xiàn)PFOA暴露小鼠的心臟發(fā)生顯著形態(tài)學(xué)改變，如纖維結(jié)構(gòu)紊亂、心肌細(xì)胞肥大、壞死，膠原結(jié)締組織增生等；此外，PFOA暴露明顯增加了心肌TC含量及血清LDH活性與心肌MDA含量，在心肌細(xì)胞損傷時(shí)，大量LDH從細(xì)胞釋放到血液。研究[13]報(bào)道，PFOA暴露所致的心肌損傷與氧自由基造成TG、TC過(guò)氧化，同時(shí)加快細(xì)胞中Ca2+負(fù)荷過(guò)大誘發(fā)不可逆性線粒體損傷密切相關(guān)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，該含量在心肌發(fā)生過(guò)氧化損傷時(shí)呈現(xiàn)為高表達(dá)，本研究中PFOA組MDA含量高于對(duì)照組，與既往文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道相符。提示PFOA暴露對(duì)心臟具有毒性作用，可造成小鼠發(fā)生明顯的心肌損傷。

臨床研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，蘆丁在改善心肌缺血、抗氧化、心律失常，調(diào)低血清膽固醇水平、血小板聚集等多個(gè)方面具有作用。SONAM等[18]研究報(bào)道蘆丁可改善心肌缺血再灌注大鼠的心功能，預(yù)防抗氧化損傷；PRAMANIL等[19]研究采用曲克蘆丁干預(yù)蒽環(huán)類藥物建立大鼠心肌損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆丁對(duì)蒽環(huán)類藥物誘發(fā)的大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用；WANG等[20]研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁可降低心肌損傷大鼠SOD活性，增加MDA含量。

本研究發(fā)現(xiàn)蘆丁對(duì)PFOA所致小鼠血清LDH升高及心肌組織結(jié)構(gòu)損傷等有明顯的改善作用?？稍谝欢ǔ潭壬蠝p少M(fèi)DA的生成。

綜上所述，蘆丁可顯著改善PFOA造成的小鼠心肌損傷組織病理學(xué)變化，同時(shí)調(diào)控小鼠心肌MDA含量、血清LDH活性、GSH-PX活性，提示蘆丁可緩解PFOA小鼠心肌組織損傷，抑制心肌纖維化，具有一定的抗氧化保護(hù)作用。