厄貝沙坦對糖尿病大鼠心肌損傷中MAPKs信號通路及相關(guān)因子的影響

李 輝，康品方，徐慶梅，戎 李，孫 碩，張 冰，高 琴，高大勝，王洪巨

隨著我國人口老齡化的到來，心腦血管疾病已經(jīng)成為我國城鄉(xiāng)居民致死的首要因素，糖尿病作為冠狀動脈疾病、高血壓的獨立危險因素，加重了冠心病、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)病進(jìn)程。其中，糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病病人致死的主要原因之一。目前研究發(fā)現(xiàn)DCM主要病理生理機(jī)制包括心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化、左心室功能障礙和代謝紊亂等[1]。但具體發(fā)病機(jī)制并未完全闡明。因此，探究DCM發(fā)病機(jī)制及病理過程，被認(rèn)為是治療DCM的關(guān)鍵因素。MAPKs信號通路是目前發(fā)現(xiàn)的最主要的生長信號調(diào)節(jié)蛋白之一，廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),對細(xì)胞的增殖、分化與凋亡過程起著重要的作用。既往研究[2]發(fā)現(xiàn)，MAPKs信號通路及其下游因子參與高糖誘導(dǎo)的心肌損傷中炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理過程。

厄貝沙坦是一種血管緊張素Ⅱ受體抑制劑，被認(rèn)為是改善心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能、降低心力衰竭遠(yuǎn)期死亡風(fēng)險的臨床常用藥物。既往研究[3]也發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦可以減輕糖尿病心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)等，達(dá)到保護(hù)心肌損傷的作用。但厄貝沙坦是否通過影響MAPKs信號通路發(fā)揮其抗糖尿病心肌損傷作用目前尚未明確。本研究擬通過復(fù)制大鼠糖尿病心肌損傷，運用Western blotting技術(shù)檢測糖尿病心肌組織中 MAPKs通路下游因子的蛋白表達(dá)，明確厄貝沙坦是否通過調(diào)控MAPKs通路改善糖尿病心肌損傷，為后期探討糖尿病心肌損傷的分子機(jī)制提供理論依據(jù)?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 清潔級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量140～160 g，購自蚌埠醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma公司，美國)；ECL發(fā)光試劑盒(Millipore 公司，美國)；MKP-1、P38MAPK和P-ERK單克隆抗體(Abcam公司，英國)；Masson染色試劑盒，大鼠IL-1β、IL-6和IL-1 ELISA檢測試劑盒(上海朵雨生物，中國)。

1.2 分組及糖尿病大鼠模型制備 將大鼠于實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為糖尿病4周(DM4W)組、糖尿病8周(DM8W)組、糖尿病8周+厄貝沙坦(DM8W+Ir)組、對照(Con)組、高糖高膽固醇飲食(HC)組，各10只。禁食12 h后測定各組血糖，其中DM4W、DM8W、DM8W+Ir組大鼠腹腔注射STZ 55 mg/kg，DM8W+Ir組給予厄貝沙坦50 mg·kg-1·d-1灌胃，Con組和HC組給予同等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃，造模成功后第4周，處死DM4W組大鼠并留取心臟組織標(biāo)本，其余各組繼續(xù)飼喂至第8周。

1.3 大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、體質(zhì)量(body weight，BW)、心體比(heart weight/body weight，H/B)及左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVWI)測定 DM4W組大鼠造模成功并飼喂4周、其余組大鼠飼喂至第8周處死前，清晨檢測大鼠FBG及BW。處死大鼠后取出心臟組織，運用0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗后濾紙吸干水分，檢測全心質(zhì)量，分離左心室再次稱重；計算H/B、LVWI。

1.4 Masson染色觀察心肌纖維化 取各組大鼠心肌組織，以4%多聚甲醛固定，經(jīng)洗滌、脫水、透明、浸蠟和包埋處理后制作成約3 μm石蠟切片，Masson染色觀察膠原含量，評估心肌組織纖維化。

1.5 ELISA法測定心肌細(xì)胞白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-1表達(dá)水平 取各組大鼠心肌組織加入0.9%氯化鈉溶液充分研磨后離心取上清液。測量時依據(jù)大鼠IL-1β、IL-6、IL-1 ELISA檢測試劑盒使用說明書操作；酶標(biāo)儀在450 nm 測定各樣本OD值，應(yīng)用Curve-Expert 1.3軟件轉(zhuǎn)換成濃度水平。

1.6 Western blotting法檢測心肌細(xì)胞MKP-1、P38MAPK、P-ERK1/2蛋白表達(dá) 取各組大鼠心肌組織100 mg剪碎，加入裂解液,碾磨成乳糜狀,4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液；按BCA蛋白定量試劑盒說明書操作，取80 μg上清液，蛋白定量后，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜至 PVDF 膜；分別加入MKP-1、P38MAPK和P-ERK一抗，4 ℃孵育過夜。次日洗滌后加入二抗IgG孵育，ECL 試劑盒進(jìn)行曝光成像，并測定條帶的灰度值，計算MKP-1/β-actin、P38MAPK/β-actin和P-ERK/β-actin蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG、BW、H/B及 LVWI比較 HC組大鼠FBG、BW、H/B、LVWI與Con組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Con、HC組比較，各糖尿病組大鼠FBG均明顯升高，BW均降低，H/B及LVWI均增高(P<0.05～P<0.01)；與DM4W、DM8W組比較，DM8W+Ir組H/B及LVWI均降低(P<0.05～P<0.01)(見表1)。

表1 各組大鼠FBG、BW、H/B及 LVWI比較

2.2 各組大鼠心肌纖維化表現(xiàn) Masson染色后，顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織，心肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)綠色，Con組和HC組心肌細(xì)胞排列規(guī)則，膠原纖維呈條索狀散在分布；DM4W組、DM8W組大鼠心肌組織纖維粗大，堆積成片狀，分布不均，沉積增多，DM8W+Ir組大鼠心肌組織心肌形態(tài)則有明顯改善(見圖1)。

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-1水平比較 HC組大鼠IL-1β、IL-6、IL-1水平與Con組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Con組和HC組比較，各糖尿病組大鼠IL-1β、IL-6和IL-1水平均升高(P<0.05)；與DM4W組和DM8W組比較，DM8W+Ir組IL-1β、IL-6和IL-1水平均降低(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-1水平比較

2.4 各組大鼠心肌組織MKP-1、P38MAPK、P-ERK1/2蛋白表達(dá)水平比較 HC組MKP-1、P38MAPK、P-ERK1/2蛋白表達(dá)與Con組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與HC組比較，各糖尿病組大鼠P38MAPK、P-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯增加，MKP-1表達(dá)降低(P<0.05)；與DM8W組相比，DM8W+Ir組P38MAPK、P-ERK1/2蛋白表達(dá)均明顯降低，而MKP-1表達(dá)增加(P<0.05)(見圖2、表3)。

表3 各組大鼠心肌組織MKP-1、P38MAPK、P-ERK1/2蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

糖尿病心肌損傷是引起心力衰竭的重要因素之一，其主要對心臟結(jié)構(gòu)及功能障礙產(chǎn)生影響[4-5]。本研究通過復(fù)制2型糖尿病大鼠模型發(fā)現(xiàn)，與Con組及HC組相比，DM組大鼠體質(zhì)量明顯減低，符合糖尿病“體質(zhì)量減輕”的典型臨床表現(xiàn)。H/B和 LVWI升高提示糖尿病大鼠心肌肥厚，Masson染色提示糖尿病大鼠心肌組織纖維雜亂無章，成網(wǎng)狀堆積，表明高糖加重心肌組織纖維化程度，同時，給予厄貝沙坦干預(yù)后，糖尿病心肌組織在纖維化程度和反映炎癥指標(biāo)IL-1β、IL-6、IL-1方面均有不同程度的改善。

隨著研究的深入，糖尿病心肌損傷是一種多機(jī)制綜合病理結(jié)果。目前，對糖尿病心肌損傷目前還沒有統(tǒng)一認(rèn)識，其可能涉及心肌細(xì)胞內(nèi)代謝障礙、細(xì)胞肥大、炎性反應(yīng)、自噬及凋亡、組織基質(zhì)纖維化等多個環(huán)節(jié)[6-7]。其中，炎性反應(yīng)最早被認(rèn)為參與糖尿病心肌損傷病理過程，高血糖可通過誘導(dǎo)高水平活性氧而導(dǎo)致機(jī)體慢性低度炎癥狀態(tài)。而炎性介質(zhì)IL-1β和IL-1是DCM許多病理生理過程的共同起點[8]。本研究也通過ELISA法檢測大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)炎癥細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、IL-1表達(dá)水平，結(jié)果表明各糖尿病組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)因子表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步證實了炎性反應(yīng)在糖尿病心肌損傷中發(fā)揮重要作用。

MAPKs信號通路是哺乳動物細(xì)胞間傳遞細(xì)胞肥大和增殖的重要信息通路,其主要亞群P38MAPK 及 ERK1/2通過激活細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和激活蛋白-1在炎癥反應(yīng)中的發(fā)揮重要作用。因此MAPKs信號通路成為抗炎性反應(yīng)的重要靶點[9]。ERK1/2與細(xì)胞生長、分化、增殖和凋亡的調(diào)控關(guān)系最為密切，其被外界各種生長因子、離子射線、過氧化氫等作用后進(jìn)而激活；隨后，進(jìn)入細(xì)胞核作用于 c-myc、激活蛋白-1、NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，其可通過磷酸化多種底物蛋白在細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、凋亡及惡性轉(zhuǎn)化等過程中均起重要作用[10]。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，甲基CPG結(jié)合蛋白2通過激發(fā)ERK1/2活性觸發(fā)心臟成纖維細(xì)胞增殖，加速心肌纖維化進(jìn)程。ERK1/2活性受其下游 MKP-1的調(diào)控,MKP-1使磷酸化ERK1/2去磷酸化而失去活性。由于 MKP-1對 MAPKs去磷酸化有較高的特異性,因此在 MAPKs活性調(diào)節(jié)方面起重要作用。P38MAPK信號通路與細(xì)胞對應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，如炎癥和氧化應(yīng)激[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn),在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟損傷模型中P38MAPK被活化,且表達(dá)均增加。其機(jī)制可能與糖尿病腎病激活體內(nèi)炎性反應(yīng)，使TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎性因子表達(dá)增多,同時這些炎性因子又可激發(fā)P38MAPK信號通路,形成惡性循環(huán)有關(guān)。

因此，有研究者猜想抑制MAPKs信號通路是否對糖尿病心肌損傷具有保護(hù)作用。近期CAO等[14]研究發(fā)現(xiàn)，香菇菌屬多聚糖可以通過調(diào)節(jié)MAPKs信號通路降低長期暴露在高糖溶液中小鼠胰島β細(xì)胞受到的損傷，其機(jī)制可能與香菇菌屬多聚糖抑制P38MAPK的活性有關(guān)。本研究運用Western blotting法檢測心肌組織MKP-1、P38MAPK、P-ERK1/2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與Con組及HC組相比，DM組大鼠心肌組織內(nèi)反應(yīng)MAPKs信號通路因子P38MAPK、P-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高、下游 MKP-1因子表達(dá)降低，說明MAPKs信號通路參與糖尿病心肌損傷病理過程。其分子機(jī)制可能是高糖的細(xì)胞外刺激通過 MAPKs 信號通路的P38MAPK、P-ERK1/2并行通路和MAPKs 通路間的“對話”共同調(diào)節(jié)糖尿病心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡過程。因此，本研究也進(jìn)一步證實了MAPKs 信號通路在糖尿病心肌損傷發(fā)生進(jìn)展過程中的多種細(xì)胞病理反應(yīng)起著重要的調(diào)控作用。

厄貝沙坦通過抑制機(jī)體中腎素血管緊張素系統(tǒng)發(fā)揮擴(kuò)張血管平滑肌、改善血管微循環(huán)、抑制基質(zhì)的合成，降低細(xì)胞的死亡率等作用。既往研究[15]表明厄貝沙坦對糖尿病心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，張冠軍等[15]通過厄貝沙坦干預(yù)1型糖尿病大鼠模型發(fā)現(xiàn)，厄貝沙坦可以通過調(diào)節(jié)MMPs信號通路及相關(guān)因子減輕糖尿病心肌組織纖維化程度。本研究中，通過給予DM8W+Ir組大鼠厄貝沙坦干預(yù)后也發(fā)現(xiàn)，MAPKs信號通路及相關(guān)因子的標(biāo)記物及炎性指標(biāo)較單純糖尿病組大鼠有明顯改善，同時心肌細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)也有一定的恢復(fù)。同時提示厄貝沙坦可能通過抑制MAPKs 信號通路的表達(dá)，減輕了心肌損傷中的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等病理過程發(fā)揮心肌保護(hù)作用。