純凈水和堿性天然礦泉水對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松影響的比較

周潔心, 王志媛, 蔡圣寶

(1.昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院,云南 昆明 650500；2.云南天外天天然飲料有限責(zé)任公司,云南 昆明 650500)

隨著人們生活質(zhì)量的提高，人們對(duì)健康越來越崇尚，對(duì)水的要求也越來越高.市面上水的種類很多，純凈水，礦物質(zhì)水，堿性礦泉水等.根據(jù)WHO飲用水指南報(bào)告，長(zhǎng)期飲用去礦物質(zhì)水可能對(duì)人類健康具有一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)[1-2].相較于純凈水，一方面礦泉水中的礦物元素，特別是一些微量元素可以補(bǔ)充人體所需，另一方面礦泉水中的礦物元素可以使得水體呈飽和狀態(tài)從而減少加工和包裝過程中有害物質(zhì)的滲入.人體是由多種元素組成的，根據(jù)元素在體內(nèi)含量的不同又分為宏量元素及微量元素2大類.微量元素的含量雖然低，但是對(duì)人體卻至關(guān)重要，一些微量元素是酶不可缺少的輔酶因子，同時(shí)還參與了體內(nèi)各項(xiàng)激素的調(diào)節(jié)[3].有研究表明長(zhǎng)期飲用純凈水會(huì)使得青年男性的血清脂質(zhì)分布趨向病理性不良變化，升高其動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，而飲用天然水則不會(huì)[4].另外，水中的礦物元素的組成和含量也會(huì)極大地影響到水的pH值.據(jù)一項(xiàng)2008年對(duì)我國(guó)24款常見瓶裝水的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，市面上常見的瓶裝水pH差異較大，其中純凈水pH在5.5左右，天然礦泉水pH在6.9左右.另據(jù)報(bào)道，通常美國(guó)絕大部分的自來水和瓶裝水等飲用水的pH都在6.7～7.4[5].雖然目前有人群研究表明堿性天然礦泉水可以降低骨吸收，并且發(fā)現(xiàn)堿性富含鈣的礦泉水比酸性富含鈣的礦泉水具有更好的降低骨吸收作用，有利于骨健康[6-7].但關(guān)于長(zhǎng)期飲用純凈水和堿性天然礦泉水對(duì)維甲酸引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥是否存在不同影響的比較研究卻較少.因此，本文主要目的就是初步比較研究長(zhǎng)期飲用純凈水和堿性天然礦泉水對(duì)維甲酸引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥的影響.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 藥品與試劑

純凈水 (pH 6.0±0.5) 和堿性天然礦泉水 (pH 9.3±0.6) 均為市售瓶裝飲用水.維甲酸(純度>98%)，購(gòu)于源葉生物.堿性磷酸酶，血清鈣、磷測(cè)試試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所, 其他試劑均為分析級(jí).

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

12只體重為 230 g 左右的SPF級(jí)雌性大鼠購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(川)2015-030.具體飼養(yǎng)條件為：飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，全天通風(fēng)，自由飲水和飲食.適應(yīng)1周后，將大鼠禁食 12 h 后，記錄初始體重，按體重將大鼠隨機(jī)分為2組，分別為純凈水組和堿性天然礦泉水組，每組6只.各組大鼠均連續(xù)2周灌胃維甲酸(0.5%羥甲基纖維素鈉助溶)誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松，灌胃劑量為 75 mg/kg，灌胃體積 5 mL/kg.2周后停止給予維甲酸，繼續(xù)飼養(yǎng)3周后，禁食 12 h 記錄最終體重，然后通過斷頸法處死所有大鼠，摘除每只大鼠的肝、脾、腎以及卵巢，并記錄重量，并分離出股骨骨骼.

1.3 血清鈣、磷含量及堿性磷酸酶活性測(cè)定

用含肝素鋰的真空采血管收集血液，3 500 r/min 轉(zhuǎn)速下 4 ℃ 離心 5 min 后取上清液，即血清.按照試劑盒的操作指示，測(cè)定每只大鼠的血鈣、血磷含量及堿性磷酸酶活性.

1.4 股骨的相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

取右后側(cè)股骨，剔除周圍的肌肉組織，浸泡于固定液(4%多聚甲醛溶液)中，用于進(jìn)一步分析和組織形態(tài)學(xué)觀察.右側(cè)股骨的皮質(zhì)骨和骨小梁利用高分辨(分辨率:48 mm)Micro-CT(LCT-200，Hitachi Aloka Medical. Ltd. Tokyo, Japan)進(jìn)行掃描分析，掃描的X線能量為 50 KV，0.5 mA；相關(guān)的骨系數(shù)包括松質(zhì)骨密度(Cancell-BMD)、皮質(zhì)骨密度(Ct-BMD)、總骨密度(T-BMD)、皮質(zhì)骨厚度(Ct-Th)、骨小梁面積(Ct-Ar)和骨極距(polar moment).

1.5 股骨的組織形態(tài)學(xué)測(cè)量

將固定的右后側(cè)股骨浸泡于脫鈣液中，脫鈣4周后經(jīng)梯度乙醇脫水和石蠟包埋后，分別沿橫向和縱向兩個(gè)方向切成 5 μm 厚的切片，用于相應(yīng)的染色.其中，橫切的股骨用于H&E染色(蘇木精和伊紅染色)和TRAP染色(抗酒石酸酸性磷酸酶染色)來觀察骨小梁和破骨細(xì)胞；縱切的股骨也用H&E染色來觀察皮質(zhì)骨.

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有的數(shù)據(jù)經(jīng)Origin 8.5 軟件處理后，結(jié)果均以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)，并用單因素方差分析Tukey檢驗(yàn)評(píng)估組間顯著性差異(p<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 體重和臟器指數(shù)

大鼠初始體重、終體重、肝、脾、腎和卵巢指數(shù)(見表1).由表1可知，在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，2組大鼠的體重沒有顯著差異(p>0.05)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的時(shí)候，2組大鼠的體重也沒有明顯差異(p>0.05).臟器指數(shù)是指某種臟器與體重之比，用于評(píng)價(jià)各臟器受損的程度[8].由表1可知，2組大鼠的肝、脾、腎和卵巢指數(shù)均無明顯差異(p>0.05)，說明純凈水和堿性天然礦泉水在該實(shí)驗(yàn)期內(nèi)對(duì)大鼠各臟器沒有明顯的差異影響.

表1 不同飲水組中大鼠的體重及臟器指數(shù)

2.2 血清Ca、 P、 ALP的含量

鈣是1種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在大多數(shù)新陳代謝過程中都有參與，磷酸鹽則為骨骼和牙齒提供了機(jī)械剛性，而人體99%的鈣都存在于骨骼和牙齒中，并且骨骼中的鈣處于動(dòng)態(tài)平衡中，其對(duì)維持血鈣是十分重要的[9].如表2所示，堿性天然礦泉水組血清鈣濃度為(1.54±0.09)mmol/L,稍高于純凈水組(1.53±0.10)mmol/L，但二者之間沒有顯著性差異(p>0.05).血清中磷的含量也表現(xiàn)出了與血鈣相同的趨勢(shì)，純凈水組血清磷濃度為(2.90±0.05)mmol/L，堿性天然礦泉水組為(2.94±0.07)mmol/L，二者之間仍沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p>0.05).堿性磷酸酶(ALP)是一組特異性的磷酸酯酶，幾乎存在于所有生物體中，人體中骨、肝臟和腎臟中均含有[10].在分子生物學(xué)研究中，ALP常作為檢測(cè)骨骼健康的血清標(biāo)志物，如在骨折愈合期、骨軟化癥、佝僂病以及骨質(zhì)疏松等疾病中，ALP的活性會(huì)顯著升高[11].如表2所示，純凈水組和堿性天然礦泉水組的ALP濃度分別為(27.69±0.64)U/L和(26.99±1.13)U/L，就平均值而言，堿性天然礦泉水組ALP活性較純凈水組降低了約2.5 %，但二者之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p>0.05).

表2 不同處理組中大鼠的血磷 (P)、血鈣 (Ca) 和堿性磷酸酶 (ALP) 結(jié)果

2.3 股骨相關(guān)指標(biāo)的CT結(jié)果

骨骼的骨質(zhì)包括骨密質(zhì)和骨松質(zhì)，其中骨密質(zhì)又叫皮質(zhì)骨，致密且堅(jiān)硬，抗壓力強(qiáng)；而骨松質(zhì)又叫松質(zhì)骨，是骨骼內(nèi)在骨小梁的支撐下所形成的不規(guī)則立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[12].圖1是Micro-CT的掃描結(jié)果，a為皮質(zhì)骨，b為松質(zhì)骨.如圖1a所示，堿性天然礦泉水組的皮質(zhì)骨厚度較純凈水組厚度稍厚，且純凈水組骨內(nèi)腔邊緣明顯鋸齒化.從表3的結(jié)果可以看出，堿性水組的皮質(zhì)骨厚度(Ct-Th)顯著高于純凈水組的Ct-Th，增加了約8.6%(p<0.05).表3中皮質(zhì)骨密度(Ct-BMD)的分析表明堿性天然礦泉水組的Ct-BMD雖然平均值稍高于純凈水組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p>0.05).圖1b是松質(zhì)骨的掃描結(jié)果，純凈水組的骨小梁稍少于堿性天然礦泉水組.據(jù)表3中松質(zhì)骨密度(Cancell-BMD)結(jié)果，堿性天然礦泉水組的骨小梁平均密度比純凈水組的提高了6.1%，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(p>0.05).另外，堿性天然礦泉水組的總骨密度(T-BMD)稍高于純凈水組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(p>0.05).

圖1 Micro-CT對(duì)不同組中大鼠股骨的皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨掃描分析

表3 不同飲水組中大鼠的股骨相關(guān)參數(shù)結(jié)果

2.4 形態(tài)組織學(xué)分析

H&E染色常用于觀察組織形態(tài)是否發(fā)生損傷[13].如圖2所示，a和b分別是皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的染色鏡檢結(jié)果.在圖2a中，2個(gè)組的皮質(zhì)骨都出現(xiàn)了不同程度的裂紋.純凈水組較堿性天然礦泉水組裂紋更加明顯.圖2b中松質(zhì)骨的鏡檢結(jié)果也呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì).純凈水組的骨小梁稍微變薄且出現(xiàn)了裂紋，骨小梁之間的間距增大；堿性天然礦泉水組的骨小梁也出現(xiàn)了裂紋，但是損傷程度要稍輕于純凈水組，且骨小梁間距較純凈水組稍窄.另外，由表3的結(jié)果可知，堿性天然礦泉水組的骨小梁平均面積比純凈水組的增加了約4.2%，但沒有顯著差異 (p>0.05).皮質(zhì)骨質(zhì)地堅(jiān)硬主要起支撐人體的作用，而骨小梁按照骨所承受的壓力和張力的方向排列，具有較高的骨扭轉(zhuǎn)能力[12].由于皮質(zhì)骨厚度和骨小梁面積的變化，骨極距(Polar moment)也發(fā)生相應(yīng)的變化.表3顯示骨極距的變化趨勢(shì)與皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的趨勢(shì)基本一致，堿性天然礦泉水組的平均骨極距比純凈水組的增加了2.7%，但未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異(p>0.05).

圖2 不同飲水組中維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠股骨的皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的形態(tài)學(xué)分析

2.5 破骨細(xì)胞的分析

骨質(zhì)疏松癥是最常見的代謝性骨病，主要是由于控制骨形成的成骨細(xì)胞和控制骨吸收的破骨細(xì)胞之間的失衡造成的，并伴有骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)改變和脆性骨折發(fā)生[14].如圖3所示，股骨中的破骨細(xì)胞被染成橘紅色，天然堿性礦泉水組的破骨細(xì)胞明顯少于純凈水組.據(jù)表3的定量結(jié)果可以看出，純凈水組的破骨細(xì)胞數(shù)量顯著高于天然堿性礦泉水組，比天然堿性礦泉水組的多了約20.36% (p<0.05).

圖3 不同飲水組中大鼠股骨的破骨細(xì)胞的染色分析(×200)

3 結(jié)語

通過對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松雌性大鼠的體重、臟器指數(shù)、血液指標(biāo)、骨骼參數(shù)及組織形態(tài)學(xué)的分析.結(jié)果表明，純凈水和堿性天然礦泉水對(duì)大鼠的體重和臟器指數(shù)沒有顯著的影響.堿性天然礦泉水組大鼠的血鈣、血磷濃度與純凈水組沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05).就ALP的平均值而言，堿性天然礦泉水組要好于純凈水組，但不具有顯著差異(p>0.05).另外，堿性天然礦泉水組的Ct-BMD 、Cancell-BMD、T-BMD、Tb-Ar和Polar moment等骨參數(shù)的平均值均稍優(yōu)于純凈水組，但同樣不具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05).但是，堿性天然礦泉水組的Ct-Th 要顯著地好于純凈水組(p<0.05).同時(shí)，堿性天然礦泉水組的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯少于純凈水組(p<0.05).根據(jù)本研究結(jié)果提示，堿性天然礦泉水可能具有一定的緩解維甲酸誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松癥癥狀的作用.但是，由于大鼠和人在生理代謝上存在一定的差異，因此，堿性天然礦泉水對(duì)人骨質(zhì)疏松是否具有一定緩解作用還需要后續(xù)大量的人群臨床研究證實(shí).