響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲輔助提取芒果葉中多酚和黃酮工藝及抗氧化活性研究

張 靜，陶俊葓，劉 銀，劉 倩，楊周昊，李孟容，程桂廣

(昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南 昆明 650500)

芒果(MangiferaindicaL.)是最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶植物之一，其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)廣受人民喜愛，主要產(chǎn)于熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]，我國(guó)是芒果主要生產(chǎn)國(guó)之一，資源非常豐富.芒果葉作為芒果的農(nóng)副產(chǎn)品，產(chǎn)量豐富，含有大量天然抗氧化劑，如酚酸、類黃酮、木質(zhì)素和半裂環(huán)烯醚類等[2].芒果葉具有平喘、止咳、去痰、免疫、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、和抗氧化活性[3].多酚和黃酮類成分是其重要的生理活性物質(zhì)[4-5].

目前植物功能成分的提取方法有溶劑浸提法，酶解法，超聲輔助提取法，微波輔助提取法和超臨界流體萃取法[6-7].其中，超聲波輔助提取是利用超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)、機(jī)械作用使植物細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)快速釋放、擴(kuò)散并溶解進(jìn)入溶劑中，同時(shí)可以較好地保持提取物的結(jié)構(gòu)和活性，具有時(shí)間短、提取率高[8]，消耗溶劑少、避免高溫對(duì)有效成分的破壞等特點(diǎn)，對(duì)酚類等熱敏性物質(zhì)，超聲提取優(yōu)勢(shì)尤為明顯[9].

響應(yīng)曲面法通過建立連續(xù)變量的模型，對(duì)各影響因素及交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)，同時(shí)用曲面圖和等高線圖表示出來，比正交設(shè)計(jì)更直觀、精確，該方法已廣泛用于中藥提取、食品工業(yè)等領(lǐng)域[10].本文采用超聲輔助提取方法對(duì)芒果葉中的多酚和黃酮進(jìn)行提取，通過響應(yīng)曲面法對(duì)提取溶劑、料液比以及提取時(shí)間3因素進(jìn)行工藝優(yōu)化，確定最佳提取工藝，并研究其抗氧化活性，為芒果葉進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芒果樣品于2019年7月采摘于云南元江，經(jīng)真空冷凍干燥 48 h 過0.441 mm篩后保存于冰箱備用.

甲醇、乙醇、丙酮均購(gòu)買上?？筛呒?nèi)軇┯邢薰荆籘PTZ、DPPH、ABTS、福林酚試劑、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(分析純)購(gòu)于Sigma-Aldrich 公司；實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備蒸餾水.

1.2 主要儀器與設(shè)備

ZD-F12真空冷凍干燥機(jī)(南京載智自動(dòng)化設(shè)備有限公司)；AL204型電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；TDL-40B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠) ；SpectraMax M5 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；SCQ-數(shù)控加熱超聲波清洗機(jī)(上海聲彥超聲波儀器有限公司)；UPHW-I-90T優(yōu)普系列超純水機(jī)(成都超純科技有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；Q250B型高速多功能粉碎機(jī)(上海冰都電器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海愛郎儀器有限公司).

1.3 方法

1.3.1 多酚黃酮含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]，用Folin-Ciocalteu (FC)法測(cè)定提取物的總酚(TPC)含量.樣品用甲醇溶解，在 0.5 mL 的FC試劑和 0.4 mL 蒸餾水的混合液中加入提取物溶液 0.6 mL，混合均勻，反應(yīng) 1 min 后，分別加入 1.5 mL Na2CO3(m/v=0.2 g/mL)和 6 mL 蒸餾水.將整個(gè)反應(yīng)體系放置在 70 ℃ 下水浴 10 min.待冷卻到室溫，在 765 nm 下，通過酶標(biāo)儀測(cè)其吸光值.沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.總酚含量表示為每克樣品中含有沒食子酸(GAE)的量(mg GAE/g提取物).

1.3.2 黃酮含量的測(cè)定

總黃酮(TFC)的含量根據(jù)文獻(xiàn)[12]所描述的比色法測(cè)定.在 0.3 mL 的5%NaNO2和 3.8 mL 70%乙醇混合液中添加 1.2 mL 的提取物溶液，使其充分混合，反應(yīng) 8 min 后，分別加入 0.3 mL 10% Al(NO3)3、4.0 mL 4% NaOH、0.4 mL 的70%乙醇溶液、混合體系在室溫下反應(yīng) 12 min 后，用酶標(biāo)儀在 510 nm 處測(cè)量吸光度.蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的總黃酮含量表示為每mg樣品含有蘆丁(RE)的量(mg RE/g提取物).

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別考察溶劑類型(70%乙醇、70%甲醇、70%丙酮、蒸餾水)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(g/mL)(1∶15、1∶20、1∶30、1∶35)、超聲時(shí)間(20、30、40、60 min)對(duì)芒果葉多酚、黃酮含量的影響.

1.3.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定提取溶劑為乙醇，通過Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面，將芒果葉多酚、黃酮含量(mg/g)(Y)作為響應(yīng)值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)3個(gè)因素，進(jìn)行響應(yīng)面分析(3因素3水平)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1.

表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.5 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

使用比色法[13]測(cè)定芒果葉的DPPH自由基清除能力.0.1 mmol/L DPPH工作液需要現(xiàn)用現(xiàn)配的，0.5 mL 的提取物溶液或Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液與 2 mL DPPH工作液混合，混合均勻后，在 25 ℃ 下避光反應(yīng) 30 min.用酶標(biāo)儀在 517 nm 處測(cè)量吸光度.提取物的DPPH自由基清除能力按公式(1)計(jì)算.

(1)

其中，A0空白對(duì)照組吸光值：0.5 mL 乙醇 + 2.0 mL DPPH工作液；Ax0樣品對(duì)照組吸光值：0.5 mL 樣品 + 2.0 mL 乙醇；Ax樣品吸光值：0.5 mL 樣品 +2.0 mL DPPH工作液.

1.3.6 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

ABTS自由基清除能力的測(cè)定方法按照現(xiàn)有文獻(xiàn)[14]的報(bào)道并稍作修改.7 mmol/L ABTS+溶液和 40 mmol/L 的過硫酸鉀溶液按照5∶88比例進(jìn)行混合，使混合液在室溫避光條件下反應(yīng) 12 h 后，得到ABTS+工作液.1 mL ABTS+工作液用 100 mL 左右的無水乙醇進(jìn)行稀釋，在波長(zhǎng) 734 nm 使其吸光值為0.7 ± 0.02. 0.5 mL 的提取物溶液或Trolox溶液中加入 4 mL 的ABTS+，使其充分混勻，混合液在 37 ℃ 的避光環(huán)境中反應(yīng) 6 min，之后使用酶標(biāo)儀在 734 nm 下測(cè)定吸光值.以Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品，做標(biāo)準(zhǔn)曲線.提取物的ABTS自由基清除能力按公式(2)計(jì)算.

(2)

其中，A0空白對(duì)照組吸光值：0.5 mL 乙醇 + 4.0 mL ABTS工作液;A1樣品對(duì)照組吸光值：0.5 mL 樣品 +4.0 mL 乙醇;A2樣品吸光值：0.5 mL 樣品 + 4.0 mL ABTS工作液.

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為均值±方差，采用Origin 8.5繪圖軟件繪圖，SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并進(jìn)行差異分析，p<0.05表示差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溶劑類型對(duì)芒果葉多酚和黃酮含量的影響

如圖1所示，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇、70%甲醇、70%丙酮和蒸餾水按1∶25(g/mL)的料液比和 30 min 超聲時(shí)間在同一超聲波清洗儀中超聲3次所得到的芒果葉多酚、黃酮含量(mg/g).結(jié)果顯示，多酚、黃酮的提取結(jié)果一致，含量由高到低依次是70%乙醇>70%甲醇>70%丙酮>蒸餾水.70%乙醇提取芒果葉多酚的能力與稍稍高于70%甲醇，但兩者差別不大，因?yàn)榈郊状季哂幸欢ǖ亩拘裕蔬x擇提取溶劑為70%乙醇.

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)芒果葉多酚和黃酮含量的影響

如圖2所示，用體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%的乙醇按1∶25(g/mL)料液比和 30 min 超聲時(shí)間在同一超聲波清洗儀中超聲3次所得到的芒果葉多酚、黃酮含量(mg/g)，結(jié)果顯示當(dāng)乙醇濃度為70%的芒果多酚、黃酮含量(mg/g)最高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～70%，多酚含量(mg/g)增加，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%時(shí)，多酚含量(mg/g)明顯下降.因?yàn)槿軇w積分?jǐn)?shù)較低時(shí)不能完全溶解植物體內(nèi)的多酚物質(zhì)，而溶劑體積分?jǐn)?shù)過高又會(huì)溶出植物體內(nèi)其他醇溶性或脂溶性雜質(zhì)從而導(dǎo)致多酚含量(mg/g)降低.因此選擇70%乙醇作為最適溶劑.

圖1 溶劑類型對(duì)芒果葉多酚(A)和黃酮(B)含量的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)芒果葉多酚(A)和黃酮(B)含量的影響

2.1.3 料液比對(duì)芒果葉多酚和黃酮含量的影響

如圖3所示，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇按料液比 1∶15、1∶20、1∶30、1∶35(g/mL)在同一超聲波清洗儀中超聲 30 min，提取3次所得到的芒果葉多酚、黃酮含量(mg/g)，結(jié)果顯示當(dāng)料液比為 1∶20 時(shí)，芒果葉多酚、黃酮含量(mg/g)最高，再增加料液比時(shí)，多酚、黃酮含量(mg/g)降低.原因可能是過多的溶劑溶解了植物體內(nèi)其他雜質(zhì)從而導(dǎo)致多酚、黃酮含量降低.因此從提取效果和經(jīng)濟(jì)條件綜合考慮，最適料液比為 1∶20(g/mL).

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)芒果葉多酚和黃酮含量的影響

如圖4所示，同時(shí)用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇按料液比1∶20(g/mL)在同一超聲波清洗儀超聲20、30、40、60 min 所得到的芒果葉多酚、黃酮含量(mg/g)，結(jié)果顯示當(dāng)超聲時(shí)間在 30 min 和 60 min 時(shí)多酚含量較高且兩者相差不大，考慮到經(jīng)濟(jì)因素，選擇最適超聲時(shí)間為 30 min.

圖3 料液比對(duì)芒果葉多酚(A)和黃酮(B)含量的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)芒果葉多酚(A)和黃酮(B)含量的影響

2.2 響應(yīng)曲面法對(duì)芒果葉多酚黃酮含量提取工藝優(yōu)化的結(jié)果

通過單因素試驗(yàn)結(jié)果來看，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間對(duì)芒果葉多酚、黃酮含量的影響相對(duì)較大，所以選擇這3種因素再進(jìn)一步設(shè)計(jì)Box-Behnken，響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2.

表2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

續(xù)表

用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得芒果葉多酚含量Y1和黃酮含量Y2(mg/g)對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)的二項(xiàng)式多項(xiàng)回歸方程為：

Y1=45.09-3.88A+2.85B+0.45C-0.29AB-0.85AC-2.82BC+3.58A2-0.36B2-4.38C2

Y2=5.74-0.27A+0.65B+0.22C-1.09AB+0.070AC+0.23BC+-0.042A2-1.07B2-0.84C2

由表3可知，模型的p值小于0.05該模型，表明該模型差異顯著.模型的相關(guān)系數(shù)R2= 0.885 4，表明該模型擬合度良好，模型的調(diào)整確定系數(shù)R2adj=0.738 1，表明該模型能夠解釋73.81%的響應(yīng)值的變化.用此模型來分析和預(yù)測(cè)超聲提取芒果葉中的多酚效果是可行的.從方差分析結(jié)果來看，一次項(xiàng)A、B，二次項(xiàng)A2、C2對(duì)芒果葉多酚的提取影響是顯著的；一次項(xiàng)C，二次項(xiàng)B2，交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)芒果葉多酚的提取影響不顯著.從而表明各影響因素對(duì)芒果葉多酚的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系.還可以看出來各因素對(duì)芒果葉多酚提取的影響的大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)(A)>料液比(B)>提取時(shí)間(C).

由表4可知，p值大于0.05，表明該模型差異不顯著.相關(guān)系數(shù)R2=0.731 8，表明模型擬合度較差.調(diào)整確定系數(shù)R2adj=0.387 0，表明該模型能夠解釋38.70%的響應(yīng)值的變化.用此模型來分析和預(yù)測(cè)超聲提取芒果葉中的黃酮效果是可行的.從方差分析結(jié)果來看，一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2，交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)芒果葉黃酮的提取影響不顯著.從而表明各影響因素對(duì)芒果葉黃酮的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系.還可以看出來各因素對(duì)芒果葉多酚提取的影響的大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)(A)>料液比(B)>提取時(shí)間(C).

表3 多酚響應(yīng)曲面回歸模型方差分析

表4 黃酮響應(yīng)曲面回歸模型方差分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖5、6.兩組圖直觀的反應(yīng)了乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)響應(yīng)值的影響.

等高線圖同一曲線上響應(yīng)值相同，圖形中心響應(yīng)值最大，等高線圖沿某一因素軸方向曲線密度越大，說明響應(yīng)值對(duì)該因素的變化越敏感，反映在響應(yīng)面上則是曲線坡度越陡峭，等高線形狀趨向橢圓軸線與坐標(biāo)軸的角度越大，則交互作用越明顯[15].如圖5、6所示，結(jié)合表的p值可知，其乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比有顯著性影響，三者之間的交互作用較小，表明各因素對(duì)芒果葉多酚含量的影響并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系.而對(duì)芒果葉黃酮含量的影響較小，效果不顯著.

圖5 乙醇提取時(shí)間與料液比對(duì)芒果葉多酚含量的響應(yīng)曲面圖(A)和等高線圖(B)

圖6 乙醇提取時(shí)間與料液比對(duì)芒果葉黃酮含量的響應(yīng)曲面圖(A)和等高線圖(B)

2.3 芒果葉提取物的抗氧化能力

自由基是含有不成對(duì)電子的分子、原子或原子團(tuán)，在生物體的新陳代謝中起著雙重作用.抗氧化活性的測(cè)定具有多種機(jī)制，如清除活性氧、抑制脂質(zhì)氧化等，同一種樣品中會(huì)有多種抗氧化物質(zhì)同時(shí)存在，在一定程度上會(huì)出現(xiàn)協(xié)同抗氧化作用.抗氧化活性受多種因素影響[16].本文采用DPPH、ABTS自由基的清除能力2種方法來評(píng)價(jià)芒果葉抗氧化活性的變化情況.

由圖7、8可見，芒果葉提取物有一定的抗氧化能力，且隨著芒果葉提取物質(zhì)量濃度(ρ)的增加，樣品的DPPH清除率和ABTS清除率也逐漸增加，文良娟等[17]研究了芒果葉中多酚和黃酮的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)芒果葉中多酚和黃酮對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除效果，且對(duì)于DPPH自由基的清除作用高于同等濃度的VC溶液，與本研究的結(jié)果一致，且芒果葉作為一種經(jīng)濟(jì)作物副產(chǎn)物，原料廉價(jià)易得，因此芒果葉是一種較好的天然抗氧化劑的原材料，為其在今后作為新型的食品抗氧化劑的研究開發(fā)提供了理論依據(jù).

圖7 不同質(zhì)量濃度芒果葉提取物的DPPH自由基清除能力 圖8 不同質(zhì)量濃度芒果葉提取物的ABTS自由基清除能力

3 結(jié)語(yǔ)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定提取的溶劑類型，通過3因素3水平的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)芒果葉多酚黃酮的含量進(jìn)行提取優(yōu)化以及其抗氧化活性的測(cè)定.結(jié)果表明，響應(yīng)曲面法優(yōu)化后的提取工藝為：70%乙醇、1∶20料液比(g/mL)和 30 min 提取時(shí)間.綜合DPPH 和ABTS清除能力的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)芒果葉抗氧化作用明顯，是一種良好的天然抗氧化劑來源.