兩種新型冠狀病毒抗體檢測(cè)試劑的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

寧樂(lè)平，劉曉春△，姜偉豪，吳榮才，黃日江，陽(yáng)文輝

1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西南寧 530000;2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院邕武院區(qū)檢驗(yàn)科，廣西南寧 530000

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)傳染性強(qiáng)，其核酸檢測(cè)是目前診斷SARS-CoV-2引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的金標(biāo)準(zhǔn)，但核酸檢測(cè)存在假陰性率高、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、測(cè)定結(jié)果易受多種因素影響等缺點(diǎn)，而且核酸單項(xiàng)檢測(cè)不能滿足疫情期間對(duì)疑似病例快速篩查的要求。隨著臨床對(duì)COVID-19診療經(jīng)驗(yàn)的積累，最新有研究指出，SARS-CoV-2抗體+核酸聯(lián)合檢測(cè)能夠彌補(bǔ)核酸檢測(cè)準(zhǔn)確性的不足，而且基于膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)檢測(cè)SARS-CoV-2抗體突破了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)對(duì)人員、場(chǎng)所、儀器的限制，縮短檢測(cè)時(shí)間，操作方便快速，在基層醫(yī)療單位及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用[1-6]。本文對(duì)廣州萬(wàn)孚生物科技有限公司(簡(jiǎn)稱萬(wàn)孚)和英諾特(唐山)生物科技有限公司(簡(jiǎn)稱英諾特)生產(chǎn)的GICA試劑檢測(cè)SARS-CoV-2總抗體、IgM、IgG的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月16日至3月1日在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院邕武院區(qū)經(jīng)核酸檢測(cè)陽(yáng)性的COVID-19確診患者69例作為確診病例組，確診患者均符合文獻(xiàn)[2]診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男16例、女53例，平均年齡為(43.7±14.5)歲，從發(fā)病到采樣時(shí)間最短為10 d，最長(zhǎng)為46 d，平均(30.3±8.3)d。另選取同期在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院邕武院區(qū)排除SARS-CoV-2感染的38 例體檢人員作為陰性對(duì)照組，其中男8例、女30例，平均年齡為(40.2±7.4)歲。陰性對(duì)照組為無(wú)COVID-19相關(guān)臨床癥狀且經(jīng)過(guò)兩次鼻咽拭子核酸檢測(cè)陰性(兩次檢測(cè)時(shí)間間隔至少1周)。確診病例組和陰性對(duì)照組在性別及年齡分布方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究遵守國(guó)際協(xié)調(diào)理事會(huì)臨床試驗(yàn)規(guī)范和赫爾辛基宣言，經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象均采集空腹靜脈血3 mL，置于真空采血管內(nèi)，靜置待血液凝固，3 500 r/min離心10 min，取血清備用。采集研究對(duì)象鼻咽拭子進(jìn)行SARS-CoV-2核酸的檢測(cè)。

1.2.2SARS-CoV-2抗體檢測(cè) 采用萬(wàn)孚生產(chǎn)的GICA試劑(批號(hào)：W19500206)檢測(cè)血清SARS-CoV-2總抗體(不能區(qū)分IgG和IgM)，檢測(cè)針對(duì)棘突蛋白(S蛋白)抗體。同時(shí)，采用英諾特生產(chǎn)GICA試劑(批號(hào)：20200205)檢測(cè)血清IgG和IgM，檢測(cè)針對(duì)S蛋白和核衣殼蛋白(N蛋白)抗體，該試劑可以區(qū)分IgG和IgM。檢測(cè)操作步驟參考試劑說(shuō)明書(shū)。

1.2.3SARS-CoV-2核酸檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(ABI Prism 7500)購(gòu)自美國(guó)ABI公司，核酸提取試劑盒購(gòu)自湖南圣湘生物科技股份有限公司(批號(hào)：202003)，使用湖南圣湘生物科技股份有限公司生產(chǎn)的Natch S全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)進(jìn)行核酸提取。擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自湖南圣湘生物科技股份有限公司(批號(hào)：202007)，針對(duì)SARS-CoV-2 編碼ORF 1ab 及N 蛋白基因的特異性保守序列為靶區(qū)域，進(jìn)行了雙靶標(biāo)基因的設(shè)計(jì)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)體系包含有內(nèi)源性的內(nèi)標(biāo)引物和探針，通過(guò)是否檢出內(nèi)標(biāo)來(lái)判斷標(biāo)本是否合格，減少假陰性結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1萬(wàn)孚與英諾特試劑、核酸檢測(cè)診斷效能比較 萬(wàn)孚總抗體和英諾特IgG聯(lián)合IgM 的診斷效能比較見(jiàn)表1。確診病例組中萬(wàn)孚總抗體、英諾特IgM、英諾特IgG、英諾特IgG聯(lián)合IgM陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性對(duì)照組中萬(wàn)孚總抗體、英諾特IgM、英諾特IgG、英諾特IgG聯(lián)合IgM陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 萬(wàn)孚與英諾特試劑、核酸檢測(cè)診斷效能比較

2.2萬(wàn)孚總抗體和英諾特IgM聯(lián)合IgG診斷性能比較 萬(wàn)孚總抗體和英諾特IgM聯(lián)合IgG一致性檢驗(yàn)kappa值為0.918(P<0.05)，說(shuō)明萬(wàn)孚總抗體和英諾特IgM聯(lián)合IgG兩種結(jié)果間的一致性程度好。見(jiàn)表2。

表2 萬(wàn)孚總抗體與英諾特IgM聯(lián)合IgG診斷性能比較(n)

2.3陰性對(duì)照組中3例患者SARS-CoV-2抗體與核酸檢測(cè)結(jié)果不一致 本研究陰性對(duì)照組中3例患者SARS-CoV-2抗體與核酸檢測(cè)結(jié)果不一致，2例患者出現(xiàn)“兩次核酸陰性+萬(wàn)孚總抗體陰性+英諾特IgM弱陽(yáng)性+英諾特IgG陰性”的結(jié)果，1例患者出現(xiàn)“兩次核酸陰性+萬(wàn)孚總抗體陰性+英諾特IgM陰性+英諾特IgG弱陽(yáng)性”的結(jié)果。此外，確診病例組有4例患者出現(xiàn)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)，這4例患者的萬(wàn)孚總抗體均為陽(yáng)性，說(shuō)明患者體內(nèi)存在針對(duì)S蛋白的抗體。

2.4確診病例組SARS-CoV-2抗體出現(xiàn)與消失的時(shí)間 確診病例組英諾特IgG抗體產(chǎn)生率100%。確診病例組中，英諾特IgM最早轉(zhuǎn)陰的時(shí)間為13 d，最長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間大于46 d，具體能持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間有待后續(xù)隨訪跟蹤。英諾特IgG最早小于10 d產(chǎn)生，最早25 d轉(zhuǎn)陰。

3 討 論

GICA試劑檢測(cè)SARS-CoV-2抗體的方法，在流行病學(xué)調(diào)查的方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究使用萬(wàn)孚和英諾特生產(chǎn)的GICA試劑檢測(cè)SARS-CoV-2抗體，靈敏度和特異度均較高，高于羅效梅等[7]采用的江蘇美克醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)GICA試劑檢測(cè)SARS-CoV-2的IgM聯(lián)合IgG的靈敏度(92.1%)、特異度(90.7%)，以及梁穎等[8]、SHEN等[9]報(bào)道的IgG聯(lián)合IgM的靈敏度和特異度?？赡芘c不同研究中的患者數(shù)量、人群不同有關(guān)。

抗體檢測(cè)可以彌補(bǔ)核酸檢測(cè)靈敏度的不足，但抗體檢測(cè)也存在一定比例的“假陽(yáng)性”。類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、溶菌酶、使用鼠抗體治療等內(nèi)源性因素，以及標(biāo)本溶血、儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、凝固不全等分析前因素，都可以導(dǎo)致“假陽(yáng)性”[6]。

陰性對(duì)照組中3例英諾特IgG和IgM與核酸檢測(cè)結(jié)果不一致的可能原因如下：(1)2例患者英諾特IgM弱陽(yáng)性，存在“初次感染載量極低的SARS-CoV-2并處于感染早期，病毒載量低于核酸檢測(cè)下限，機(jī)體產(chǎn)生少量IgM，尚未產(chǎn)生IgG”的可能性，但是2例患者均無(wú)任何COVID-19的癥狀、CT無(wú)陽(yáng)性表現(xiàn)、相隔1周的兩次核酸檢測(cè)陰性，綜合考慮是英諾特IgM假陽(yáng)性；(2)另外1例英諾特IgG弱陽(yáng)性，可能存在“既往感染SARS-CoV-2，但已恢復(fù)或體內(nèi)病毒被清除，免疫應(yīng)答產(chǎn)生的IgG維持時(shí)間長(zhǎng)，仍存在于血液中而被檢測(cè)到”的可能性，但是該患者無(wú)任何COVID-19的癥狀、CT無(wú)陽(yáng)性表現(xiàn)、相隔1周的兩次核酸為陰性、萬(wàn)孚總抗體陰性，綜合考慮是英諾特IgG假陽(yáng)性。以上3例英諾特IgM或IgG假陽(yáng)性，可能是檢測(cè)N蛋白抗體的假陽(yáng)性所致。英諾特試劑檢測(cè)S蛋白和N蛋白的抗體，而萬(wàn)孚試劑檢測(cè)S蛋白抗體。如果患者體內(nèi)僅存在干擾N蛋白抗體的物質(zhì)，就可導(dǎo)致萬(wàn)孚總抗體陰性而英諾特IgM或IgG陽(yáng)性的結(jié)果。反之，如果患者只有針對(duì)N蛋白的抗體，萬(wàn)孚總抗體存在一定漏診的風(fēng)險(xiǎn)。

SARS-CoV-2暴發(fā)于上呼吸道感染流行季節(jié)，hCoV-NL63，hCoV-OC43，hCoV-229E，hCoV-HKU1感染引起的上呼吸道感染患者可影響SARS-CoV-2抗體的檢測(cè)結(jié)果[10-15]。被SARS-CoV-2感染過(guò)的患者體內(nèi)是否存在與N蛋白或S蛋白有交叉反應(yīng)的抗體，是抗體檢測(cè)中面臨的重要問(wèn)題。S蛋白是介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵蛋白[13]。ZHENG等[14]通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)推測(cè) S蛋白可能是未來(lái)治療性抗體和疫苗的潛在靶點(diǎn)。

本研究出現(xiàn)4例SARS-CoV-2核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)的患者，萬(wàn)孚總抗體均為陽(yáng)性，說(shuō)明患者體內(nèi)存在針對(duì)S蛋白的抗體。體內(nèi)存在針對(duì)S蛋白的保護(hù)性抗體，還出現(xiàn)核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)，考慮可能原因如下：(1)針對(duì)S蛋白的抗體不一定是保護(hù)性抗體；(2)針對(duì)S蛋白的抗體是保護(hù)性抗體，但是針對(duì)某一特定氨基酸序列的，而被萬(wàn)孚試劑檢測(cè)出的S蛋白抗體不是針對(duì)這一特定的氨基酸序列?？傊?，抗體的“假陽(yáng)性”問(wèn)題，是限制抗體用于COVID-19確診的關(guān)鍵因素。目前，抗體檢測(cè)主要用于疑似病例的確診或排除[4]。對(duì)于不滿足疑似病例標(biāo)準(zhǔn)的病例，抗體不作為診斷和排除依據(jù)。

本研究受多種條件限制，存在許多不足之處。例如標(biāo)本數(shù)量有限，可能對(duì)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響；其次，收集的病例多為確診10 d以上的病例；另外，對(duì)于陰性對(duì)照組的假陽(yáng)性病例追蹤時(shí)間不夠久，可能準(zhǔn)確性不足。因此需要通過(guò)多中心、大規(guī)模的臨床驗(yàn)證，進(jìn)一步明確抗體檢測(cè)在SARS-CoV-2感染診斷中的價(jià)值。