談佳瑞，陳宇鵬，徐 剛，任 鵬，曹 穎，胡尚連

（1.西南科技大學(xué)植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽621010；2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川 綿陽621010）

慈竹（Bambusa emeiensis）是西南地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)竹種，因其具有生長(zhǎng)周期短和高纖維素含量而備受科學(xué)工作者的重視，是竹漿造紙的良好原料。但由于生產(chǎn)中慈竹栽培管理粗放、產(chǎn)量和質(zhì)量低，難以滿足造紙工業(yè)對(duì)原料的需求。有研究表明，不同形態(tài)氮肥即硝態(tài)氮肥、銨態(tài)氮肥和酰胺態(tài)氮肥對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的作用有差異。代新俊等［1］對(duì)強(qiáng)筋小麥的施肥研究結(jié)果表明，相較于硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，酰胺態(tài)氮中氮（150 kg·hm-2）能夠顯著提高小麥的產(chǎn)量，在高氮（225 kg·hm-2）條件下能顯著提升強(qiáng)筋小麥的品質(zhì)。韓世潔等［2］對(duì)白羊草施氮研究表明施入60 kg·hm-2白羊草的產(chǎn)量最高達(dá)到13.5 t·hm-2，在此條件下白羊草的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量最佳。扶艷艷等［3］對(duì)冬小麥研究中表明，施用3種形態(tài)氮肥，以硝態(tài)氮肥對(duì)冬小麥產(chǎn)量和生物量的提高最為明顯。但是對(duì)于慈竹的研究以往主要集中在基因克隆、表達(dá)和纖維形態(tài)。龔道勇等［4］對(duì)慈竹bZIP基因的克隆表達(dá)以及胡尚連等［5］對(duì)慈竹理化性質(zhì)和纖維形態(tài)的研究，而不同形態(tài)氮肥對(duì)慈竹筍生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究鮮見報(bào)道。研究以慈竹為材料，通過施用3種形態(tài)的氮肥，研究不同形態(tài)氮肥對(duì)慈竹筍生長(zhǎng)和發(fā)育的影響，以及對(duì)慈竹莖稈產(chǎn)量的作用效應(yīng)，為慈竹合理施肥、提高慈竹產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院資源圃內(nèi)，未經(jīng)處理、長(zhǎng)勢(shì)均一、生長(zhǎng)健康、無病蟲害的慈竹林。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2015年6月和2016年的6月，連續(xù)2 a對(duì)慈竹林進(jìn)行不同形態(tài)氮肥施肥處理。

以竹叢為中心，在距離竹叢的20 cm處挖環(huán)形溝將肥料均勻施入土壤中。2015年土壤基礎(chǔ)肥力全氮0.17%，全磷為0.05%，全鉀1.42%，水解性氮87.37 mg·kg-1，速效鉀60.80 mg·kg-1，速效磷0.03 mg·kg-1，pH 4.89。試驗(yàn)一共設(shè)計(jì)5個(gè)處理，即只施入磷肥和鉀肥（CK）；施入酰胺態(tài)氮肥以及磷肥和鉀肥（T1）；施入硝態(tài)氮肥以及磷肥和鉀肥（T2）；施入銨態(tài)氮肥以及磷肥和鉀肥（T3），每個(gè)處理3次重復(fù)。施肥中氮磷鉀的比例為N∶P2O5∶K2O＝5∶2∶1，根據(jù)每根基徑所需要的施肥量計(jì)算每1叢竹所需要的總的施肥量，平均每根基徑施用N：1.32 g；P2O5：0.53 g；K2O：0.27 g。酰胺態(tài)氮肥為尿素，硝態(tài)氮肥為Ca（NO3）2·4H2O，銨態(tài)氮肥為（NH4）2HPO4和NH4Cl，鉀肥為K2SO4，磷肥為Ca（H2PO4）2。

2016年土壤基礎(chǔ)肥力如下：

CK處理的全氮0.15%，全磷為0.04%，全鉀1.45%，水解性氮45.77 mg·kg-1，速效鉀14.47 mg·kg-1，速效磷0.01 mg·kg-1；T1處理的全氮0.11%，全磷為0.04%，全鉀1.50%，水解性氮50.35 mg·kg-1，速效鉀21.82 mg·kg-1，速效磷0.01 mg·kg-1；T2處理的全氮0.12%，全磷為0.04%，全鉀1.38%，水解性氮57.32 mg·kg-1，速效鉀22.68 mg·kg-1，速效磷0.01 mg·kg-1；T3處理的全氮0.11%，全磷為0.04%，全鉀1.42%，水解性氮47.99 mg·kg-1，速效鉀24.44 mg·kg-1，速效磷0.01 mg·kg-1。

2016年施肥量根據(jù)公式計(jì)算：

2016年需要施入的有效氮磷鉀的量＝2015年施肥前土壤中有效氮磷鉀的含量+2015年施入的有效氮磷鉀含量-第2次施肥前土壤中有效氮磷鉀的含量。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 發(fā)筍量及生長(zhǎng)量的測(cè)定 自出筍之日起記錄竹筍的發(fā)筍量，直至出筍結(jié)束，傍晚竹筍高度減去當(dāng)天早晨的竹筍高度即為晝生長(zhǎng)量，早晨的竹筍高度減去前1天傍晚的竹筍高度即為竹筍的夜生長(zhǎng)量，同時(shí)每周測(cè)量1次竹筍的基徑。

1.3.2 竹筍形態(tài)解剖學(xué)方法 采用石蠟切片法，樣品用改良的FAA固定液（按照95%乙醇∶冰醋酸∶37%甲醛的福爾馬林∶蒸餾水＝5∶1∶1∶3進(jìn)行配制）進(jìn)行固定。將一部分脫蠟后的切片用濃度為0.005%的纖維熒光染料進(jìn)行染色，染色清晰且形態(tài)完整的切片，在Leica DMI-3000倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 葉綠素含量的測(cè)度 將丙酮和無水乙醇按2∶1的比例制成95%的水溶液［6］。稱取0.5 g去掉主脈的慈竹葉片破碎后于25mL試管中，加入提取液后置于生化培養(yǎng)箱25℃下暗提取，2 d后以提取液為對(duì)照組用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素含量，波長(zhǎng)為645 nm和663 nm，Arnon計(jì)算公式為：

葉綠素a濃度（mg·L-1）：Ca＝12.7A663-2.69A645；

葉綠素b濃度（mg·L-1）：Cb＝22.9A645-4.68A663；

葉綠素總濃度（mg·L-1）：Ca+b＝Ca+Cb。

1.3.4 NR、GS、GOGTA、蔗糖合酶和磷酸蔗糖合酶測(cè)定 參照齊一生物科技（上海）有限公司試劑盒說明書步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 可溶性糖和可溶性蛋白的測(cè)定 采用蒽酮比色法測(cè)定1年生慈竹中的可溶性糖。采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)可溶性蛋白的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用Excel、SPSS等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，CANOCO做主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮肥處理對(duì)慈竹竹筍生長(zhǎng)發(fā)育和竹材產(chǎn)量的影響

2.1.1 慈竹發(fā)筍量 在施入的氮磷鉀的比例和總量一定的時(shí)，2015年和2016年2 a的不同氮肥處理對(duì)慈竹的日均出筍量有影響。與未施入氮肥的處理相比，施入氮肥能夠明顯提高發(fā)筍量，以2016年的試驗(yàn)結(jié)果為例，酰胺態(tài)氮處理的累計(jì)日均發(fā)筍量最高，是未施入氮肥處理的123%，其次為硝態(tài)氮處理，是未施入氮肥處理的119%，銨態(tài)氮處理最低，是未施入氮肥處理的109%，但未達(dá)到差異顯著水平。分析兩年的竹筍發(fā)筍量，其動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致，都呈現(xiàn)出“S”型曲線（圖1）。

圖1 不同施肥處理慈竹平均每根基徑發(fā)筍量動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic change of the shooting number per parent bamboo in Bambusa emeiensis

2.1.2 慈竹筍高度和基徑動(dòng)態(tài)變化 隨著時(shí)間的推移，2015年和2016年2 a的慈竹筍的生長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)（圖1），竹筍的高度也不斷增加（圖2）。以不施用氮肥的竹筍的高度為基準(zhǔn)，慈竹筍生長(zhǎng)到45 d，最高的是銨態(tài)氮肥處理，其次為硝態(tài)氮處理，酰胺態(tài)氮肥處理最低，但均未達(dá)到差異顯著水平。

慈竹竹筍直徑隨著時(shí)間的推移則呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，到第50 d時(shí)酰銨態(tài)氮肥處理筍的基徑最大，其次是銨態(tài)氮肥和不施氮處理，基徑最小的是硝態(tài)氮肥處理的竹筍，但各處理間也均未達(dá)顯著性差異（圖2）。

圖2 2016年慈竹筍高度和基徑動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic change of the shoot height and the average base diameter of shoots in Bambusa emeiensis in 2016

圖3 不同氮肥處理的慈竹筍形態(tài)解剖特征Fig.3 Anatomical structure characteristics of Bambusa emeiensis shoots under the different treatments of nitrogen fertilizer

2.1.3 不同氮肥處理對(duì)竹筍形態(tài)解剖特征的影響不同形態(tài)氮肥處理間在導(dǎo)管直徑、外方纖維股厚度、中心纖維束寬和相鄰維管束間薄壁細(xì)胞厚度4個(gè)指標(biāo)上都沒有明顯差異，但不同處理間的內(nèi)方纖維股厚度和中心維管束高則存在顯著差異。施入銨態(tài)氮肥的竹筍內(nèi)方纖維股厚度和中心纖維束高都明顯要高于其他處理，酰胺態(tài)氮肥處理后的竹筍內(nèi)方纖維股厚度最?。▓D3）。

有關(guān)研究表明［7］，細(xì)胞次生壁的存在會(huì)引起雙折射現(xiàn)象，雙折射的強(qiáng)度也與細(xì)胞次生壁的沉積的厚度有關(guān)，次生壁木質(zhì)素含量越多、沉積越厚雙折射強(qiáng)度就會(huì)越強(qiáng)。與其他處理相比，銨態(tài)氮處理后竹筍維管束周圍細(xì)胞的細(xì)胞壁的雙折射現(xiàn)象很明顯（圖4），說明銨態(tài)氮能夠促進(jìn)了竹筍維管束的形成和細(xì)胞次生壁的快速形成和木質(zhì)素的沉積，導(dǎo)致維管束的高木質(zhì)化，細(xì)胞次生壁的形成和沉積的生物途徑與施肥之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

圖4 慈竹筍偏光顯微照片F(xiàn)ig.4 Polarized micrograph of section in shoots of Bambusa emeiensis

2.2 不同氮肥處理對(duì)慈竹葉片相關(guān)酶活性及相關(guān)理化性質(zhì)的影響

（1）硝酸還原酶。硝酸還原酶（NR）在植物中的活性高低會(huì)影響植物吸收利用土壤中無機(jī)氮，由于硝酸還原酶是一種誘導(dǎo)酶，所以土壤中的硝態(tài)氮（KNO3）含量的多少對(duì)硝酸還原酶的活性有很大影響［8］。硝態(tài)氮肥的施入能夠顯著提高慈竹完全展開葉中硝酸還原酶的活性，其次是銨態(tài)氮肥處理和不施氮處理，最低為酰胺態(tài)氮處理，且不同處理間的差異都達(dá)到極顯著水平（圖5A）。

（2）谷氨酰胺合成酶。氮素的同化過程對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要意義，硝態(tài)氮被還原成銨態(tài)氮才能被植物吸收，而銨態(tài)氮可以被轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺和谷氨酸用于合成蛋白質(zhì)［9］，氮素同化過程中谷氨酰胺合成酶作為關(guān)鍵酶參與其中［10］。相比較于其他試驗(yàn)組，酰胺態(tài)氮肥和不施氮處理的谷氨酰胺合成酶的活性顯著高于硝態(tài)氮肥和銨態(tài)氮肥處理組（圖5B）。

（3）谷氨酸合成酶。谷氨酸合成酶（GOGAT）在植物體內(nèi)以2種形式存在，分別是Fd-GOGAT和NAD（P）H-GOGAT，谷氨酸合成酶作為谷氨酸合成酶循環(huán)中的關(guān)鍵酶將銨態(tài)氮同化為氨基酸被植物吸收利用。結(jié)果表明：不同施肥處理間的谷氨酸合成酶活性明顯存在差異（圖5C）。酰胺態(tài)氮處理的谷氨酸合成酶活性最高，且明顯高于其他處理；其次為不施氮處理組，最低為銨態(tài)氮肥和硝態(tài)氮肥處理組（圖5C）。

圖5 不同氮肥處理的慈竹葉片硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成的活性Fig.5 Nitrate reductase，glutamyl synthtase and glutamate synthtase activity in the expanded leaves of Bambusa emeiensis treated with different kinds of nitrogen fertilization

蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶是蔗糖合成的2種途徑［11］，不同氮肥處理間蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶存在顯著差異（圖6）。蔗糖合酶活性以銨態(tài)氮肥處理組為最高，其次為硝態(tài)氮處理，再次為酰胺態(tài)氮肥處理，不施用氮肥處理的為最低（圖6A）。不同氮肥處理間的蔗糖磷酸合酶活性也明顯不同，以不施氮肥處理的酶活性為最高，其次為銨態(tài)氮肥和酰胺態(tài)氮肥處理，硝態(tài)氮處理的酶活性最低（圖6B）。

圖6 慈竹展開葉蔗糖合酶活性和蔗糖磷酸合酶的活性Fig.6 Sucrose synthase activity and sucrose phosphate synthase in the expanded leaves of Bambusa emeiensis

（5）葉綠素與可溶性糖含量。不同氮肥處理間慈竹完全展開葉葉綠素和可溶性糖含量存在差異，但未達(dá)到差異顯著水平（圖7）。氮肥形態(tài)對(duì)慈竹展開葉中可溶性蛋白含量有明顯的調(diào)控作用，不施氮處理組葉片中可溶性蛋白含量最高，其次是酰胺態(tài)氮肥處理，再次是硝態(tài)氮肥處理，銨態(tài)氮肥處理組葉片可溶性蛋白含量最低（圖7C）。

圖7 慈竹展開葉葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量Fig.7 The chlorophyll，soluble sugar and soluble protein content in the expanded leaves of Bambusa emeiensis

2.3 主成分分析

前面的結(jié)果已經(jīng)表明氮肥形態(tài)對(duì)慈竹相關(guān)的生理生化指標(biāo)有顯著的調(diào)控作用，利用主成分分析進(jìn)一步探討其生理生化指標(biāo)與發(fā)筍量之間的聯(lián)系。結(jié)果表明：對(duì)比不同處理組，施入酰胺態(tài)氮肥最有利于提高發(fā)筍量，葉中的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量對(duì)發(fā)筍量呈正向調(diào)節(jié)作用。

圖8 不同形態(tài)氮肥處理下生理生化指標(biāo)的主成分分析Fig.8 The PCA of physio-biochemical indexes treated with different forms nitrogen fertilizer

3 討論

慈竹產(chǎn)量和質(zhì)量直接關(guān)系到竹漿的產(chǎn)量和質(zhì)量。在慈竹生長(zhǎng)發(fā)育過程中，氮素的供給直接決定慈竹的產(chǎn)量和利用價(jià)值，產(chǎn)量和質(zhì)量是評(píng)定慈竹的生產(chǎn)性能和選育過程中的重要指標(biāo)。有研究表明，不同形態(tài)氮肥直接影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育［12-14］以及產(chǎn)量和質(zhì)量［1-2］。研究結(jié)果表明，不同形態(tài)氮肥對(duì)慈竹的發(fā)筍量和基徑?jīng)]有顯著的調(diào)控效應(yīng)，但是對(duì)慈竹竹筍的發(fā)育質(zhì)量有顯著的影響，銨態(tài)氮肥能夠顯著促進(jìn)竹筍維管束的形成和周圍薄壁細(xì)胞次生壁的形成或沉積。

眾多研究表明，氮肥會(huì)對(duì)植物葉綠素和相關(guān)酶的活性產(chǎn)生影響，施入一定比例的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮會(huì)促進(jìn)植物光合產(chǎn)物的積累［15］。與硝態(tài)氮肥相比，施入銨態(tài)氮肥能夠顯著提高葉片葉綠素的含量［16］。在甘蔗的研究中［17］也發(fā)現(xiàn)，相比于硝態(tài)氮肥，銨態(tài)氮肥能夠顯著提高蔗糖合酶的活性。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，氮肥形態(tài)對(duì)慈竹展開葉中的葉綠素含量和可溶性糖含量并沒有顯著的影響，但是對(duì)蔗糖合酶活性和蔗糖磷酸合酶活性分別有明顯的調(diào)控效應(yīng)，研究表明蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶都與蔗糖的合成有關(guān)［10］，試驗(yàn)中蔗糖合酶與蔗糖磷酸合酶的活性呈大致互補(bǔ)趨勢(shì)，這就可能造成了不同氮肥處理間可溶性糖含量沒有顯著性差異的結(jié)果。硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）是植物氮素代謝的關(guān)鍵酶，GS參與多種氮素代謝是氮素代謝中心的多功能酶［18］。眾多研究表明，氮素形態(tài)會(huì)影響氮代謝相關(guān)酶的活性，如王小純等［19］對(duì)小麥的研究結(jié)果表明不同形態(tài)氮肥對(duì)NR、GS和GOGAT活性有顯著影響，且GS活性和GOGAT活性與可溶性蛋白含量成顯著正相關(guān)。黃勤妮等［20］對(duì)小麥的研究中發(fā)現(xiàn)銨態(tài)氮肥比硝態(tài)氮肥更能提高谷氨酰胺合成酶活性。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，酰胺態(tài)氮肥和不施氮處理組GS活性和GOGAT活性與可溶性蛋白含量呈正相關(guān)，分析NR、GS和GOGAT活性與可溶性蛋白含量，推測(cè)NR、GS和GOGAT活性在合成可溶性蛋白的機(jī)理中可能存在疊加效應(yīng)，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

竹筍的生長(zhǎng)發(fā)育主要來自于母竹生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)積累的情況，測(cè)量母竹相關(guān)的生理生化指標(biāo)，有助于分析竹筍發(fā)育與母竹之間的關(guān)系。結(jié)果表明酰胺態(tài)氮肥對(duì)慈竹竹筍的生長(zhǎng)發(fā)育有較明顯的促進(jìn)作用，也證明氮肥對(duì)于植物的分蘗和腋芽發(fā)生有不可替代的作用，與前人研究結(jié)果相一致［21］。此外，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)氮素形態(tài)對(duì)竹筍發(fā)育質(zhì)量有顯著的調(diào)控作用，不同形態(tài)氮肥對(duì)慈竹材性的影響還有待進(jìn)一步研究。