基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析達(dá)明飲治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制研究

孫河，楊稀瑞，董霏雪，張雪松，王繼雪

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病引起的微血管病變之一[1]。目前已成為全世界中青年人群主要致盲原因[2]。血糖的持續(xù)升高，引起體內(nèi)血糖代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致多元醇通路及氧化應(yīng)激反應(yīng)等出現(xiàn)異常，是本病的主要致病因素[3]。西醫(yī)用于治療DR 的藥物有限，多在控制血糖的基礎(chǔ)上，使用羥苯磺酸鈣、蛋白激酶C 阻斷劑、糖皮質(zhì)激素、血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制劑等。糖皮質(zhì)激素雖可抑制VEGF 過度表達(dá)，緊湊毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)血視網(wǎng)膜屏障，但長時(shí)間激素治療會(huì)帶來諸多不良反應(yīng)，如眼內(nèi)壓增高、白色晶狀體形成及炎癥等；蛋白激酶C 阻斷劑可有效阻斷VEGF 受體，但會(huì)出現(xiàn)惡心、腹瀉癥狀[4]。中醫(yī)藥療法在治療DR 方面優(yōu)勢明顯，通過辨證論治，因方施藥，效果明顯，已逐步成為防治DR 進(jìn)展不可或缺的重要組成部分[5]。

達(dá)明飲是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)孫河教授自擬方劑，主要由三七、蒲黃、黃精、黃芪、川芎、女貞子等組成[6]。方中三七味微苦、甘，性溫，歸胃、肝經(jīng)，活血定痛化瘀；蒲黃味甘，性平，歸肝、心包經(jīng)，功效為止血、化瘀；黃精性平，味甘，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、潤肺、健脾、益腎之功；黃芪味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)，補(bǔ)氣固表；川芎性溫，味辛，歸肝、膽、心包經(jīng)，活血行氣效果顯著，且能疏通上述諸藥之藥性；女貞子性平，味甘、苦，歸肝、腎二經(jīng)，有補(bǔ)益肝腎、清熱明目等功效，同時(shí)具有降低血糖的作用；諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰，活血化瘀，通絡(luò)明目之功，可改善視功能。

現(xiàn)代藥理研究[7]表明，達(dá)明飲可通過降低血液黏稠度、擴(kuò)張眼底血管、增加血流量、改善視網(wǎng)膜血供，達(dá)到防護(hù)視網(wǎng)膜及眼底血管的目的。由于DR 的病理機(jī)制復(fù)雜，且達(dá)明飲作為自擬方劑，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理機(jī)制尚不明確，故系統(tǒng)地研究達(dá)明飲治療DR 的生物活性成分和分子作用機(jī)制，有利于為臨床用藥提供依據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過建立藥物與相關(guān)靶點(diǎn)、疾病與治療靶點(diǎn)間的關(guān)系進(jìn)行模型預(yù)測，整合兩者的作用網(wǎng)絡(luò)，分析藥物在各網(wǎng)絡(luò)模塊中與特定節(jié)點(diǎn)間的聯(lián)系，系統(tǒng)、整體地探究相關(guān)藥物與潛在靶點(diǎn)間的關(guān)系[8]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)達(dá)明飲進(jìn)行科學(xué)的闡釋，為臨床推廣本方提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分檢索

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，分別以“三七”“蒲黃”“黃精”“黃芪”“川芎”“女貞子”作為檢索詞，查找各中藥的化學(xué)成分。選取同時(shí)滿足口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30.00%且 類 藥 性 （drug like，DL）≥0.18 作為篩選條件。

1.2 藥物靶點(diǎn)預(yù)測

基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫，將達(dá)明飲的有效化合成分依次匹配潛在的靶點(diǎn)基因；同時(shí)，結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲取與所選化合物相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)，使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)的篩選。

1.3 確定DR 的相關(guān)靶點(diǎn)

從Gene Cards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫中以“diabetic retinopathy” 作為關(guān)鍵詞檢索與DR 相關(guān)的疾病靶基因。建立Excel 表格，將相關(guān)靶點(diǎn)基因依次錄入，并以此作為分析達(dá)明飲中藥活性成分治療DR的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建化合物活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將達(dá)明飲中有效活性成分與治療DR 的作用靶點(diǎn)同時(shí)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件，構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將達(dá)明飲治療DR 的潛在靶基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫，并限定物種為“Homo sapiens”，檢索得到靶標(biāo)-蛋白相互作用關(guān)系，以TSV 格式進(jìn)行保存。將TSV文件再次導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件，用Network Analyzer 工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，獲取Degree 值。通過Cytoscape3.7.1 軟件繪制蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，將所繪制的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖保存為“.png”格式圖片。

1.6 生物學(xué)過程及通路分析

將達(dá)明飲中各中藥成分靶點(diǎn)基因Uniprotkb 導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，形成基因列表，對(duì)該表進(jìn)行基因功能國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系（gene ontology，GO）分析及京都基因與基因組百科全書 （kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。選取錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR) 值＜0.05 的通路，使用OmicShare 網(wǎng)站繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 達(dá)明飲活性化合成分與靶點(diǎn)

共檢索獲取三七化學(xué)成分119 個(gè)、蒲黃化學(xué)成分33 個(gè)、黃精化學(xué)成分38 個(gè)、黃芪化學(xué)成分87 個(gè)、川芎化學(xué)成分189 個(gè)、女貞子化學(xué)成分119 個(gè)。以O(shè)B≥30.00%且類藥性DL≥0.18 作為限定，篩選出符合條件的活性成分三七8 個(gè)、蒲黃8 個(gè)、黃精12個(gè)、黃芪20 個(gè)、川芎7 個(gè)、女貞子13 個(gè)，選擇OB 值排名靠前的5 位化合成分進(jìn)行數(shù)據(jù)展示（表1）。

表1 達(dá)明飲活性成分

2.2 靶點(diǎn)預(yù)測

在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中輸入相應(yīng)靶蛋白，獲取119個(gè)靶點(diǎn)相應(yīng)基因。將獲取的靶基因與GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索得到的有關(guān)DR 的相關(guān)基因進(jìn)行比對(duì)，篩查出可能與DR 相關(guān)的靶點(diǎn)，共41 個(gè)（表2）。

2.3 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

本網(wǎng)絡(luò)共有288 個(gè)節(jié)點(diǎn)，化合物節(jié)點(diǎn)250 個(gè)，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)38 個(gè)、543 條邊，達(dá)明飲復(fù)方中Degree 值排名前6 的主要化合物為槲皮素、山奈酚、黃芩素、木犀草素、薯蕷皂素、β-谷甾醇；每條邊都代表著化合物與靶點(diǎn)之間的直接聯(lián)系；不同靶點(diǎn)可能對(duì)應(yīng)相同活性成分，單一靶點(diǎn)也可與不同活性成分相對(duì)應(yīng)（圖1）。

2.4 核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將2 個(gè)數(shù)據(jù)庫所獲得的DR 靶點(diǎn)進(jìn)行交集，再與達(dá)明飲的中藥有效活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行交集處理，最終獲得達(dá)明飲治療DR 的關(guān)鍵靶點(diǎn)41 個(gè)（圖2）。將41 個(gè)潛在靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，獲取蛋白相互作用關(guān)系，使用Cytoscape3.7.1 軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)。如圖可見，本網(wǎng)絡(luò)共包含41 個(gè)節(jié)點(diǎn)，208 條邊。圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊則表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)性。Degree 值排名靠前的蛋白，依次為IL6、MAPK8、VEGFA、CASP3、EGFR、ESR1（圖3）。

2.5 GO 功能富集分析

通過DAVID 注釋平臺(tái)對(duì)達(dá)明飲PPI 網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)蛋白在基因功能的作用下進(jìn)行分析，并篩選出基因數(shù)10 個(gè)以上者，分別為生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）（圖4）。其中BP 包括轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇激素受體等；CC 包括酶激活劑活性、核受體活性等；MF 包括DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、蛋白質(zhì)異二聚化活性（表3）。

2.6 KEGG 通路富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，對(duì)達(dá)明飲PPI 網(wǎng)絡(luò)中蛋白在信號(hào)通路中的作用進(jìn)行相應(yīng)分析，共得到113 條信號(hào)通路，依據(jù)P＜0.05且FDR＜0.05，篩選出10 條主要作用的信號(hào)通路。包括凋亡信號(hào)通路、磷酯酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)-1 信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、NF-KB 信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路（圖5，表4）。

表2 靶點(diǎn)預(yù)測信息

圖1 達(dá)明飲化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 達(dá)明飲-DR VENN 網(wǎng)絡(luò)圖

表3 “達(dá)明飲-DR”GO 生物過程分析

圖3 達(dá)明飲-DR PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化圖

圖4 達(dá)明飲治療DR 潛在靶點(diǎn)的GO 功能分析氣泡圖

圖5 達(dá)明飲治療DR 潛在靶點(diǎn)的KEGG 靶點(diǎn)通路柱狀圖

表4 達(dá)明飲KEGG 靶點(diǎn)通路富集結(jié)果

3 討論

中醫(yī)將DR 歸屬于“消渴目病”范疇，久病致肝腎虧虛、精血不能上承于目，發(fā)為本病。孫河教授通過多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，DR 的誘因不外乎出血與瘀血，治療應(yīng)抓主要病因病機(jī)，結(jié)合局部癥狀，整體辨證施治。本研究是從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方面分析達(dá)明飲治療DR 的分子作用機(jī)制，從藥物有效成分-疾病-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)，達(dá)明飲中槲皮素、β-谷甾醇、黃芩素、山奈酚、木犀草素等成分Degree 值較高，提示上述藥物成分可能與DR 治療密切相關(guān)?，F(xiàn)已證實(shí)，槲皮素具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，可通過VEGFR-2 受體靶向調(diào)節(jié)ACP/MTOR/P70S6K 通路，抑制體內(nèi)蛋白激酶C、ERK1/2 和細(xì)胞溶質(zhì)C 磷酸化，保護(hù)血-視網(wǎng)膜屏障免受新生血管的刺激[9-11]。β-谷甾醇具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、降低血清膽固醇和甘油三酯水平、促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)及清除、對(duì)抗血小板凝集起到保護(hù)作用[12]。研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，黃芩素對(duì)DR 患者血管通透性具有神經(jīng)保護(hù)作用；此外，黃芩素還可降低DR 小鼠視網(wǎng)膜中活性氧（reactive oxygen species，ROS） 水平和NADPH 氧化酶2 的表達(dá)，對(duì)DM 小鼠的視網(wǎng)膜具有抗炎、抗氧化及抗?jié)B透作用。山奈酚可通過抑制VEGF-2 的過表達(dá)，延緩眼底新生血管的形成[15-16]。此外，現(xiàn)代研究[17]證實(shí)，木犀草素對(duì)VEGF 誘導(dǎo)的血管生成起到抑制作用，表明木犀草素可抑制視網(wǎng)膜新生血管生成。以上諸多報(bào)道均與本研究得到的結(jié)果得到相互驗(yàn)證，證明達(dá)明飲治療DR 分子機(jī)制的科學(xué)有效性。

通過分析發(fā)現(xiàn)，靶蛋白IL-6、MAPK8、VEGFA、CASP3、EGFR 在PPI 網(wǎng)絡(luò)中的Degree 值較高，表明達(dá)明飲可能通過以上靶蛋白治療DR。IL-6 作為一種炎癥細(xì)胞因子，主要作用于機(jī)體炎癥的調(diào)節(jié)方面[18]，研究證實(shí)，增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR） 的發(fā)生與免疫應(yīng)答相關(guān)，在PDR 患者玻璃體中檢測出濃度較高的IL-6；表明炎癥免疫過程在PDR 中意義重大[19-20]。WU 等[21]報(bào)道，VEGFA 在PDR 中具有上調(diào)作用，實(shí)驗(yàn)證明在PDR 小鼠模型中下調(diào)VEGFA 水平可抑制視網(wǎng)膜中新生血管形成。OTANI 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)與DR 新生血管形成有關(guān)，通過PKC 和MAPK 信號(hào)途徑介導(dǎo)，AngⅡ可刺激視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞生成素mRNA 表達(dá)。WILSON 等[23]報(bào)道，MAPK 參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)DR 新生血管形成。KUMAR 等[24]用槲皮素治療DR 大鼠，其體內(nèi)Caspase-3表達(dá)明顯下降，提示Caspase-3 可通過網(wǎng)膜中的Bdnf-trkb/aktsynaptophysin 信號(hào)通路發(fā)揮潛在的抗凋亡作用，保護(hù)視神經(jīng)損傷。Sebastian 等[25]發(fā)現(xiàn)EGFR 是廣泛分布于細(xì)胞膜的多功能跨膜糖蛋白，其配體與EGFR 結(jié)合，可激活調(diào)節(jié)基本細(xì)胞活動(dòng)的信號(hào)通路。PARK 等[26]發(fā)現(xiàn)，EGFR 受體對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelial cells，RPE） 和Müller 細(xì)胞的遷移和增殖具有調(diào)節(jié)作用。由此可見，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果與上述結(jié)果相一致，表明達(dá)明飲可通過對(duì)以上蛋白的相互調(diào)節(jié)，從而影響DR 發(fā)生發(fā)展全過程。

通過GO 富集分析可知，達(dá)明飲治療DR 涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄的激活、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、蛋白質(zhì)異二聚化活性、近端啟動(dòng)子序列特異性DNA 結(jié)合、酶激活劑活性、染色質(zhì)結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇激素受體、酰胺鍵合等途徑。KEGG 通路富集分析提示，達(dá)明飲的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因富集與DR 密切相關(guān)的通路上，本方主要與Apoptosis、AGE-RAGE、PI3K-Akt 等通路有關(guān)。Wu 等[27]發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE 信號(hào)通路可以激發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，持續(xù)高血糖狀態(tài)下，刺激RPE 細(xì)胞、AGE-RAGE 信號(hào)被激活，導(dǎo)致視網(wǎng)膜視覺微循環(huán)功能障礙。Fletcher 等[28]發(fā)現(xiàn)，DR 的發(fā)生發(fā)展與視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。汪東生等[29]研究認(rèn)為，長期處于高糖環(huán)境下，視網(wǎng)膜細(xì)胞可見NF-κB 和Caspase-3 活化。由于DR 容易產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，造成眼底微循環(huán)障礙，故達(dá)明飲可通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)展、改善眼底微循環(huán)。

PI3K/Akt 信號(hào)通路可使視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)增殖、存活，抑制細(xì)胞凋亡[30]。DR 發(fā)生時(shí)體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)低氧和高血糖，造成VEGF 過度表達(dá)，通過KDR 和FIT-1 受體，誘導(dǎo)PI3k/Akt 信號(hào)通路，加速內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖，形成微血管腔，導(dǎo)致眼底新生血管形成[31]。Xie 等[32]發(fā)現(xiàn)，VEGF 通過激活下游PI3K/Akt信號(hào)級(jí)聯(lián)分子，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生。Zdychova 等[33]認(rèn)為，PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的血管發(fā)生、增殖、微血管通透性、存活、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和胚胎發(fā)育發(fā)揮重要作用。因此，達(dá)明飲可能通過調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡途徑、抑制新生血管生成，來達(dá)到防治DR 的作用。

綜上所述，通過對(duì)達(dá)明飲所含化合物、靶點(diǎn)、作用通路等進(jìn)行GO 分析與KEGG 分析，初步驗(yàn)證出本方治療DR 的藥理機(jī)制，為后期進(jìn)一步研究本方的機(jī)制提供有價(jià)值的科學(xué)參考。