超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定牛奶中喹賽多殘留

馬曉年，張秀清，陳俊秀，歐利華

（昆明市疾病預(yù)防控制中心，昆明 650228）

喹賽多（Cyadox，CYX）是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸藥研究所合成的一種新型抗?。?］、促生長化合物，化學(xué)名為2-喹噁啉亞甲肼基氰基乙酸-1，4-二氧化物，屬于喹噁啉-N-1，4-二氧化物的衍生物。喹賽多是喹噁啉的一個(gè)新品種，不論是對動物的一般毒性，還是特殊毒性，均比其同類藥物要好［1-3］，己作為喹乙醇的替代產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。雖然喹賽多的毒性遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的喹噁啉類藥物，但它在動物組織體內(nèi)的殘留問題仍不容忽視［4-6］。

牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。2008年1月15日，衛(wèi)生部發(fā)布的《中國居民膳食指南（2007）》介紹了新版《膳食寶塔》凸顯牛奶價(jià)值，牛奶是攝取營養(yǎng)元素的催化劑以及健康的關(guān)鍵，是健康膳食的基石［7］。隨著生活水平的提高，因其豐富的營養(yǎng)成分，牛奶成了日常生活中不可或缺的必需品。隨著奶牛飼養(yǎng)過程中抗菌及促生長獸藥的使用［8］，牛奶也會被污染。文獻(xiàn)［9，10］報(bào)道了飼料及肉中喹噁啉類藥物殘留的測定，而牛奶中喹賽多殘留的測定鮮見報(bào)道，利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了測定牛奶中喹賽多殘留的方法，該法具有操作簡單、回收率好等特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

QTRAP 4500質(zhì)譜分析儀（美國AB SCIEX）；Agilent 1290高效液相色譜儀（美國安捷倫）；高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器）；振蕩器（常州金壇恒豐儀器制造有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA）；氮吹儀（Reeko Auto EVA-30）；電子天平（METTLER，0.01 mg）；均質(zhì)器；Agela Technologies Cleanert PAX固相萃取小柱（60 mg/3 mL）；Agela Technologies Cleanert PEP固相萃取小柱（60 mg/3 mL）。

液態(tài)牛奶，市購；喹賽多標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（97%）；甲醇、乙酸乙酯（色譜純，美國JT Baker）；甲酸（優(yōu)級純）；氯化鈉（分析純）；正己烷（優(yōu)級純）；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取一定量的喹賽多標(biāo)準(zhǔn)品，先用少量的二甲亞砜溶解，再用甲醇定容，混勻，得到濃度為19.2μg/mL的儲備液，于4℃避光保存。

1.2.2 樣品提取 取10 g均質(zhì)好的牛奶樣品于50 mL離心管中，加乙酸乙酯20 mL，振蕩15 min，5 000 r/min離心10 min，取乙酸乙酯層于雞心瓶中。再加20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并2次提取液，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用5 mL 4%氯化鈉溶液溶解殘留物，加5 mL正己烷振蕩混合1 min，靜置分層，棄去正己烷。再加正己烷5 mL，重復(fù)提取1次，取下層液備用。

1.2.3 樣品凈化 PAX及PEP小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，取備用液分別過PAX及PEP固相萃取小柱，用3 mL水淋洗抽干，再用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于40℃下氮?dú)獯蹈?。?.0 mL甲醇溶解殘留物，渦旋混勻，過0.22μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定。

1.2.4 儀器條件

1）色譜。島津Inertsil ODS-3柱（3μm，2.1 mm×100 mm）；流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈-甲醇（3∶11），梯度洗脫程序見表1；流速0.30 mL/min，分析時(shí)間5 min，進(jìn)樣體積5μL，柱溫30℃。

表1 流動相梯度洗脫

2）質(zhì)譜。離子源為電噴霧離子源（ESI+）；正離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電離電壓4.5 kV；多反應(yīng)檢測（MRM）；離子源溫度450℃；噴霧器壓力275.9 kPa；輔助加熱氣241.4 kPa；氣簾氣壓力241.4 kPa；其他參數(shù)見表2。

表2 喹賽多質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)待測物的性質(zhì)，使用喹賽多標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液在ESI+模式下分別進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。選擇藥物響應(yīng)強(qiáng)度最高的m/z值作為母離子，進(jìn)行子離子掃描，并優(yōu)化去簇電壓和碰撞電壓，在MRM模式下優(yōu)化氣簾氣壓力、離子源溫度、噴霧器壓力、輔助加熱氣。

2.2 色譜條件優(yōu)化

選擇流動相時(shí)考慮到是ESI+模式，所以使用了0.1%甲酸水，有機(jī)相分別試驗(yàn)了甲醇、乙腈及兩相混合的效果。單一使用甲醇為有機(jī)相時(shí)，峰形展寬、拖尾，單一使用乙腈為有機(jī)相時(shí)，基線噪音增大。綜合考慮，選擇甲醇-乙腈混合作為有機(jī)相并試驗(yàn)了不同比例對試驗(yàn)結(jié)果的影響，最終確定（3∶11）乙腈/甲醇-0.1%甲酸水為流動相。圖1為1.920μg/mL的喹賽多標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM譜。

圖1 喹賽多標(biāo)準(zhǔn)MRM譜

2.3 提取溶劑的選擇

試驗(yàn)重點(diǎn)對比了不同的提取溶劑，包括乙酸乙酯、乙腈-乙酸乙酯（1∶9）、乙腈-乙酸乙酯（2∶8）、乙腈-乙酸乙酯（5∶5）等的提取效果。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用乙酸乙酯提取雜質(zhì)較少，提取效率高，毒性小，易揮干，故最終選擇了乙酸乙酯為提取溶劑，且采用了正己烷脫脂后再用小柱凈化。

2.4 固相萃取小柱的選擇

試驗(yàn)進(jìn)行了0.384、0.960、1.920μg 3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，比較了PAX及PEP兩種固相萃取小柱對喹賽多的保留能力。結(jié)果表明，PEP固相萃取小柱3個(gè)水平的回收率均較好，而PAX固相萃取小柱只有低水平回收率高于50%（表3），最終選擇PEP固相萃取小柱進(jìn)行樣品凈化。圖2為喹賽多標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過PEP固相萃取小柱凈化的MRM譜。

表3 兩種固相萃取柱的回收率

圖2 PEP固相萃取小柱凈化的MRM譜

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

用甲醇將喹賽多標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備成含喹賽多分別為0.384、1.152、1.920、3.840、11.520、19.200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在確定的分析條件下以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，喹賽多響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為Y=46 469.3x+8 879.3，相關(guān)系數(shù)為0.999 0，檢出限為0.01μg/g。

2.6 精密度及準(zhǔn)確度

取不含喹賽多的牛奶樣品分別過PAX及PEP固相萃取小柱進(jìn)行三水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可知，PAX固相萃取小柱回收率在10.1%～27.3%，效果不理想，而PEP固相萃取小柱在3個(gè)水平的加標(biāo)回收率均能達(dá)到62.6%以上。結(jié)合上述固相萃取小柱回收試驗(yàn)，說明PEP固相萃取小柱適宜于牛奶中喹賽多殘留的測定。圖3為牛奶樣品添加喹賽多的MRM譜。

表4 加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）

圖3 加標(biāo)樣品MRM譜

3 結(jié)論

建立了牛奶中喹賽多殘留測定的UPLC-MS/MS法，通過對PAX及PEP固相萃取柱的試驗(yàn)效果比對，發(fā)現(xiàn)PEP固相萃取柱損失小、回收率高，在牛奶中喹賽多殘留檢測上具有更大優(yōu)勢，為廣大食品檢驗(yàn)人員提供參考。