甘薯糖蛋白分離純化及結(jié)構(gòu)分析

孫昌平，王貴珍

（1.長春市食品藥品監(jiān)督管理局汽車經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)監(jiān)督管理所，吉林長春 130000；2.吉林工程技術(shù)師范學(xué)院 食品工程學(xué)院，吉林 長春 130000）

甘薯屬旋花科，甘薯屬，又稱白薯、紅薯、山芋、甜薯、地瓜等，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，是我國的主要經(jīng)濟(jì)作物之一，同時(shí)我國也是世界上甘薯產(chǎn)量最高的國家。甘薯因產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣、抗逆性和再生能力強(qiáng)、營養(yǎng)豐富而具有醫(yī)療價(jià)值，是食品工業(yè)的一種好原料[1]。

糖蛋白（Glycoprotein） 是甘薯中的一種生物活性成分，具有保持消化道、呼吸道、關(guān)節(jié)腔、膜腔的潤滑和血管彈性的生物活性，同時(shí)有降血糖、抗衰老和抗癌的作用[2]。糖蛋白是一類由糖類同多肽或蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵連接而形成的結(jié)合蛋白[3]。其結(jié)合方式主要有2 種[4]：①糖和含羥基的氨基酸以糖苷形式結(jié)合，稱為O - 連接；②糖和天冬酰胺基連接，稱為N - 連接。在生物體內(nèi)糖蛋白以不同的形式存在而發(fā)揮作用，是細(xì)胞膜、細(xì)胞間基質(zhì)、血漿、黏液、激素等的重要構(gòu)成成分，營養(yǎng)學(xué)家發(fā)現(xiàn)甘薯中含有一種獨(dú)特的黏蛋白，具有抑制膽固醇在體內(nèi)沉積、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、減少高血壓發(fā)生率、減慢人體器官老化速度等特殊生理功能[5]?？茖W(xué)家也指出，甘薯具有防治糖尿病、白血病等多種疾病的作用[6]。甘薯是我國四大糧食作物之一，也是食品工業(yè)、輕工業(yè)和飼料工業(yè)的重要原料，其中含有的甘薯糖蛋白（SPG） 大量存在于甘薯淀粉生產(chǎn)的廢水之中[7]，若采用適當(dāng)?shù)氖侄螌⑵浞蛛x提取，將產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

試驗(yàn)對甘薯水溶性糖蛋白進(jìn)行了分離純化，獲得了純度較高的甘薯水溶性糖蛋白，同時(shí)對其性質(zhì)進(jìn)行了研究，確定了分離糖蛋白的糖肽鍵類型、糖苷鍵的連接方式及其類型，分析了氨基酸的組成，為甘薯功能性食品的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 儀器、試劑及材料

1.1 儀器

723 型可見分光光度計(jì)、FA 2004 B 型分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；8000 型低速離心沉淀機(jī)，常州國華儀器有限公司產(chǎn)品；RJ-TDL-5A 型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，常州恒隆儀器有限公司產(chǎn)品；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；GZX-9240 MBE 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；R-201 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州華瑞儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋，常州億通分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；UV-2201 型紫外- 可見分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；Biochrom型全自動(dòng)氨基酸分析儀，美國通用公司產(chǎn)品；紅外掃描儀，常州博恒電子科技有限公司產(chǎn)品；77530-01 型真空冷凍干燥系統(tǒng)，北京松源華興生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；FSD-70 型實(shí)驗(yàn)室粉碎磨，上海嘉定糧油儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

無水乙醇、丙酮、無水乙醚、氯仿、正丁醇、濃硫酸、磷酸緩沖溶液（pH 值2.2）、濃鹽酸、6 mol/L鹽酸、0.2 mol/L 鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、無水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、液溴、苯酚、酚酞、Tris 、鹽酸羥胺、無水吡啶、乙酸酐、葡萄糖，均為分析純。

1.3 材料

甘薯，DEAE-22（進(jìn)口分裝）；Sephadex G-150，北京東凱元醫(yī)藥生物技術(shù)研究院提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠提供；牛血清蛋白，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 技術(shù)路線

原料預(yù)處理→切碎烘干→粉碎→浸提→有機(jī)溶劑沉淀→干燥得粗品。

2.2 甘薯糖蛋白的提取

將新鮮甘薯清洗、去皮、切塊，置于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干、粉碎；精確稱取30.000 g，加入450 mL蒸餾水，于60 ℃下浸提1 h，離心得上清液，反復(fù)浸提3 次。浸提液在40 ℃下真空濃縮至50 mL 后加入150 mL 無水乙醇，沉淀[8]，得到糖蛋白粗品SPG1。

2.3 甘薯糖蛋白的純化

2.3.1 甘薯糖蛋白純化的技術(shù)路線

Sevage 試劑除雜蛋白→透析去除游離蛋白→濃縮→DE-22 層析柱純化→Sephadex G-150 層析柱純化→透析、濃縮、干燥得純品。

2.3.2 除雜蛋白

稱取適量SPG1 溶解與蒸餾水中，加入4 倍體積Sevage 試劑（氯仿∶正丁醇= 4∶1） 充分振蕩混勻，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min[9]；然后將糖蛋白液體置于透析袋內(nèi)于流動(dòng)水中過夜透析；收集透析液，真空濃縮至50 mL 后加入3 倍體積的無水乙醇，收集沉淀，于40 ℃下真空干燥得糖蛋白粗品SPG2。

2.3.3 DEAE- 22 柱層析

稱取SPG2 并溶解，上樣至預(yù)先平衡好的OH- 型DEAE-22 纖維柱，分別用0.05，0.10，0.50 mol/L 的NaHCO3溶液50 mL，每管收集5 mL，逐管檢測OD490nm（多糖吸收峰） 和OD280nm（蛋白質(zhì)吸收峰），合并同時(shí)含蛋白質(zhì)和多糖的洗脫液，經(jīng)透析、沉淀和干燥獲得甘薯糖蛋白半純品SPG3。

2.3.4 Sephadex G- 150 柱層析

稱取甘薯糖蛋白SPG3 溶解于0.02 mol/L Tris-HCl 緩沖液溶解（pH 值7.2） 并上樣至預(yù)先平衡好的SephadexG-150 層析柱中，洗脫，收集洗脫液，經(jīng)透析、沉淀和干燥獲得甘薯糖蛋白半純品SPG4。

2.4 甘薯糖蛋白中多糖含量的測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用苯酚-硫酸法測定甘薯糖蛋白純品中多糖含量。

準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖0.010 0 g，溶解并定容至100 mL，獲得質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取6 支刻度試管，依表1 加入試劑。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線加料見表1。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線加料

充分反應(yīng)后，檢測490 nm 條件下吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，SPG4 溶解，依次加入苯酚和硫酸，充分反應(yīng)后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定SPG4 中多糖含量。

2.5 甘薯糖蛋白中蛋白質(zhì)含量的測定

用Folin- 酚法測定甘薯糖蛋白純品中蛋白質(zhì)含量。稱取0.025 0 g 牛血清白蛋白，溶解后定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為250 μg/mL 的牛血清白蛋白溶液，取6 支刻度試管，依表2 加入試劑，配制不同質(zhì)量濃度的牛血清蛋白溶液。

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制作加料見表2。

表2 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制作加料

向各試管中加入Folin - 酚甲試劑5 mL，混勻后室溫下放置10 min，分別加入試劑乙0.5 mL，立即混勻，30 min 后以0 號(hào)管為對照，檢測各管OD750nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。SPG4 溶解，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的方法依次加入Folin - 酚甲、乙試劑，反應(yīng)完全后，測定樣液吸光度，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量。

2.6 氨基酸組成分析

分別取20 mg SPG2 和SPG4 于水解管中，加入6 mol/L 的鹽酸溶液10 mL，抽真空，沖入氮?dú)猓夤?，?10 ℃下水解22 h ，取出冷卻后，定容至50 mL，過濾后取濾液1 mL 于25 mL 燒杯中，蒸干后加入磷酸緩沖溶液攪拌均勻，用氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸分析。

2.7 紅外吸收光譜分析

取15 mg SPG4 加入100 mg kBr 充分研磨后，進(jìn)行壓片，在400～4 000 cm-1用紅外光譜掃描儀進(jìn)行掃描。

3 結(jié)果與分析

3.1 糖蛋白的一般性質(zhì)

糖蛋白純品SPG4 為白色粉末，易溶于水。

3.2 DEAE-22 纖維素柱層析純化

DEAE-22 洗脫曲線見圖1。

經(jīng)DEAE-22 纖維素層析柱初步純化后得到1 個(gè)主峰，收集此高峰部分，經(jīng)透析去除無機(jī)雜離子，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加入無水乙醇沉淀后經(jīng)冷凍干燥即得到甘薯糖蛋白半純品SPG3。

3.3 Sephadex G-150 柱層析純化甘薯水溶性糖蛋白結(jié)果分析

Sephadex G-150 洗脫曲線見圖2。

SPG3 經(jīng)Sephadex G-150 柱層析洗脫后得到2 個(gè)主峰，其中第1 個(gè)峰值高，對稱性好，分離度好。故收集合并此重疊峰部分，經(jīng)透析、濃縮、沉淀和干燥獲得甘薯糖蛋白純品SPG4。

3.4 甘薯糖蛋白中多糖含量測定結(jié)果

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測得SPG4 中蛋白含量為75.1%。

3.5 甘薯糖蛋白中蛋白含量測定結(jié)果

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測得SPG4 中蛋白含量為23.9%。

3.6 糖蛋白的氨基酸組成分析

甘薯水溶性糖蛋白純品酸水解液的氨基酸分析圖譜如下。

SPG2 氨基酸組成分析（440 nm） 見圖5，SPG2氨基酸組成分析（570 nm） 見圖6，SPG4 氨基酸組成分析（440 nm） 見圖7，SPG2 氨基酸組成分析（570 nm） 見圖8，甘薯水溶性糖蛋白粗品和純品中氨基酸含量見表3。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，甘薯水溶性糖蛋白幾乎含有人體所需的各種氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸含量較高。除色氨酸在酸水解時(shí)被破壞未被檢測外，甘薯水溶性糖蛋白含有7 種必需氨基酸，表明甘薯水溶性糖蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)。

表3 甘薯水溶性糖蛋白粗品和純品中氨基酸含量

3.7 甘薯水溶性糖蛋白的紅外光譜分析

甘薯水溶性糖蛋白的紅外光譜圖見圖9。

從圖9 可以看出，SPG4 的特征吸收峰（cm-1）分別在3 398（-OH），2 927，2 961（-N-H），1 647，1 558（-C=O-），1 396 (-C-C-) ，1 050（-C-O-），831，702（-C=C-H）。其中，1 647，558（-C=O-）為肽鏈上酰胺基羰基的吸收峰，3 398（-OH），1 050（-C-O-） 為多糖分子的特征吸收峰，831 cm-1附近的吸收峰表明SPG4 中含有α- 糖苷鍵，由1 050 cm-1附近的吸收峰可知SPG4 的糖苷鍵類型主要為吡喃型。

4 結(jié)論

試驗(yàn)所得甘薯糖蛋白純品為白色粉末，易溶于水，糖含量75.1%%，蛋白質(zhì)含量23.9%。氨基酸分析表明，SPG4 含7 種必需氨基酸是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)。紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，SPG4 含有吡喃型α -糖苷鍵。