口蹄疫液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的注意事項(xiàng)

秦百眾

（河南省平輿縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 463400）

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的可導(dǎo)致豬、牛、羊等動(dòng)物感染的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，為一類動(dòng)物疫病，且為人畜共患病，也是我國(guó)強(qiáng)制免疫的病種之一，其危害巨大，目前主要通過(guò)疫苗免疫接種對(duì)其進(jìn)行預(yù)防控制。但對(duì)疫苗免疫抗體的檢測(cè)不僅可以評(píng)估接種疫苗的免疫效果，也可以為養(yǎng)殖場(chǎng)制訂更加合適的疫苗免疫方案提供一定的指導(dǎo)意見。液相阻斷ELISA現(xiàn)主要用于豬、牛、羊血清口蹄疫A型、O型抗體的檢測(cè)，是目前我國(guó)認(rèn)可的一種標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)，其具有高靈敏性、特異性的特點(diǎn)，但液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程較復(fù)雜，操作步驟較煩瑣，稍有不慎會(huì)造成實(shí)驗(yàn)失敗。筆者總結(jié)分析了近幾年實(shí)驗(yàn)室實(shí)際操作時(shí)出現(xiàn)的問(wèn)題，總結(jié)了液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)，以期為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員提供借鑒。

1 試劑配制

1.1 樣品稀釋液的配制

使用濃縮磷酸鹽-吐溫緩沖液 （PBST）液配制1倍PBST之前，要先確保濃縮液混合均勻，冬季天氣寒冷，溫度較低時(shí)，易有結(jié)晶，使用前需用恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋待結(jié)晶融化后使用，配制好的1倍PBST可于4℃冰箱儲(chǔ)存1周。

1.2 抗原的配制

根據(jù)實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，不同批次的試劑盒所使用的病毒抗原工作濃度略有不同，故每次實(shí)驗(yàn)前需先確定好病毒抗原的工作濃度。若病毒抗原的工作濃度為1：10，其配制方法為1ml病毒抗原加入9ml配制好的1PBST。病毒抗原的配制宜現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 樣品的稀釋

根據(jù)工作需要可選擇10份、20份或40份樣品布局，樣品布局不同，血清樣品的稀釋方法不同。倍比稀釋時(shí)要注意盡量不要有氣泡，將10道排槍插入樣品孔底，留一定空隙，使槍頭始終保持在液面以下，緩慢吹吸6～8次即可。

稀釋板的第11列為陽(yáng)性對(duì)照的稀釋，其成敗關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的判定，即實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵處之一。陰陽(yáng)對(duì)照的稀釋最好單獨(dú)進(jìn)行，使用單槍，倍比稀釋規(guī)則同上。

3 加病毒抗原

稀釋板的前11列整體加入配制好的病毒抗原50uL，第12列的陰性對(duì)照兩孔亦加入50uL病毒抗原，第12列的3、4孔為空白對(duì)照孔什么都不加，第12列的最后4孔為病毒抗原對(duì)照孔，加入100uL病毒抗原。此步驟在樣品量大時(shí)需注意，確保每塊稀釋板都加病毒抗原，加完后仔細(xì)觀察每板液體量是否一致。

4 轉(zhuǎn)板

樣品不是整塊板時(shí)，比如做20份布局樣品，但某塊板上只有10份樣品，容易出現(xiàn)漏轉(zhuǎn)情況。故此步驟需注意，無(wú)論稀釋板上是否整板樣品，均要整板轉(zhuǎn)板。

5 洗板

洗板前確保洗板機(jī)洗液孔通暢、無(wú)堵塞；洗板時(shí)要仔細(xì)觀察，確保無(wú)漏孔、溢孔現(xiàn)象。

6 加樣

在樣品量較大，所用包被板較多時(shí)，無(wú)論轉(zhuǎn)板、洗板、還是加樣都應(yīng)按照某一特定順序確保每塊板反應(yīng)時(shí)間均足夠。加樣時(shí)注意懸空垂直加樣。

7 顯色

液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)的顯色底物分為A和B兩種，可混合使用，但需注意要現(xiàn)用現(xiàn)配，且配制好的底物混合物在使用前要避光。且底物顯色時(shí)間要根據(jù)室溫的不同進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，如室溫較高 （比如炎熱的夏季）時(shí)，底物反應(yīng)時(shí)間應(yīng)相應(yīng)縮短；而室溫較低 （比如寒冷的冬季）時(shí)，底物反應(yīng)時(shí)間可略微延長(zhǎng)。

8 酶標(biāo)儀讀值

樣品量較大時(shí)要仔細(xì)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)板數(shù)與最后讀值板數(shù)量是否一致，避免漏讀。

9 結(jié)果判定

9.1 結(jié)果有效性的判定

（1）病毒抗原對(duì)照孔的平均OD450nm應(yīng)大于1.0； （2）陽(yáng)性對(duì)照抗體效價(jià)在1：1024±1以內(nèi)，臨界值為阻斷50%反應(yīng)孔的對(duì)照OD450nm值，為病毒對(duì)照4孔中去掉最高值、最低值，剩余2孔的對(duì)照D450nm值除以4，即臨界值應(yīng)處于第11列的E孔與G孔值之間； （3）陰性對(duì)照血清的抗體效價(jià)＜1：8，即隱形對(duì)照2孔 （第12列的前2孔）的數(shù)值均應(yīng)大于臨界值。

9.2 血清樣品結(jié)果的判定

樣品抗體效價(jià)≥1：128為抗體陽(yáng)性，1：64～1：128時(shí)判為可疑，＜1：64判為陰性。部分豬血清樣品可能會(huì)出現(xiàn)跳孔現(xiàn)象，經(jīng)咨詢?cè)噭┖邢嚓P(guān)技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)，這可能與豬血清中某些成分有關(guān)，遇到這種情況即按稀釋的最大倍數(shù)樣品孔值作為判定結(jié)果。