豬塞尼卡谷病毒診斷方法的研究進展

林正丹 連凱琪 周玲玲 宋玉偉

（河南省動物疫病防控與營養(yǎng)免疫院士工作站/河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國際聯(lián)合實驗室/安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院455000）

上個世紀80 年代就報道過美國、新西蘭等國家出現(xiàn)一種病因不明的豬水皰病[1]。 其臨床癥狀為病豬鼻部和蹄部出現(xiàn)水泡、潰瘍或糜爛，但檢測結(jié)果卻排除了口蹄疫病毒病和豬水皰病。 據(jù)報道，2004 年美國一個州的豬群出現(xiàn)了水泡性疾病癥狀，但當(dāng)時并未確診。 直到2007 年美國、加大拿豬群爆發(fā)水泡性疾病，最后排除豬水皰病后，確診為塞尼卡谷病毒（Seneca Valley Virus，SVV） 感染。 自 2015 年美國中部往西大多數(shù)地區(qū)豬群爆發(fā)感染SVV 后，泰國、巴西、哥倫比亞等國家也爆發(fā)出該疫情。 2016 年到2017 年我國福建，黑龍江、河南等省豬群陸續(xù)發(fā)生SVV 感染[2]。 雖然SVV 疫情不像口蹄疫在全球范圍傳播，但部分地區(qū)的豬群大量死亡也給養(yǎng)殖場帶來一定的經(jīng)濟損傷，因此盡快確診疫情，控制其蔓延是首要的。

為了能區(qū)分塞尼卡谷病毒病、口蹄疫病毒病和豬水皰病的臨床癥狀，短時間做出判斷，盡早采取措施進行預(yù)防和控制疫情，往往采用實驗室方法進行SVV 確診。 本文旨在對SVV 的相關(guān)診斷方法進行總結(jié)。

1 病原學(xué)診斷方法

1.1 病毒分離

該方法是將采集病豬剖檢組織研磨成懸液，-20℃反復(fù)凍融離心過濾除菌接種到敏感離體細胞，再經(jīng)過一系列操作進行核酸或者SVV 檢測鑒定。 2016 年趙曉亞等[3]首次分離鑒定出國內(nèi)的塞內(nèi)卡谷病株，收集從2015～2016 年廣東省各地區(qū)豬場疑似感染SVV 病畜的內(nèi)臟組織和水泡滲出液、糞便樣本進行病毒分離和傳代培養(yǎng)后，在顯微鏡下觀察到一些細胞死亡，病變細胞變圓，表面粗糙且折光性增強。 張志等[4]采取無臨床癥狀豬群的內(nèi)臟組織樣本，分離病毒，檢測為陽性。 病毒分離方法傳代培養(yǎng)能較好的控制單一條件，保證分離出純種病毒并且能估定滴度，但是耗時耗力。

1.2 電子顯微鏡觀察

Laura M.Hales 等[5]用直接涂敷法將純化的SVV 在涂有碳涂層的聚醋酸甲基乙烯脂網(wǎng)格上，用醋酸鈾酰水溶液對細胞進行整塊染色，乙醇脫水，滲透并包埋在塑料樹脂中； 用金剛石切60～80nm 的超薄切片，安裝在銅網(wǎng)格上； 然后用乙酸鈾酰和檸檬酸雷諾茲鉛對網(wǎng)格進行染色，并使用透射電鏡放大25 萬～61 萬倍進行檢測。 使用電子顯微鏡觀察SVV 雖然結(jié)果直觀，但制作過程復(fù)雜且需要昂貴的儀器，耗費人力物力。

2 免疫學(xué)診斷方法

2.1 病毒中和試驗

用終點稀釋法測定SVV 血清中抗體的中和活性，將血清滅活后連續(xù)稀釋2 倍，與等體積100TCID50 的SVV 混合，37℃溫育1h，加入NCI-H1299 細胞培養(yǎng)72h 后觀察細胞病變情況，并測定細胞病變?yōu)?0%～100%被抑制時為中和抗體效價[6]。

2.2 競爭ELISA

Ming Yang 等[6]采用二乙胺滅活SVV 抗原免疫小鼠制備單克隆抗體，建立了SVV 競爭性酶聯(lián)免疫吸附 （cELISA） 實驗，并且與間接ELISA 和病毒中和試驗結(jié)果進行比較。 Melissa Goolia 等[7]首先驗證了以前開發(fā)的 cELISA，充分證明出cELISA 可做檢測不同物種SVV 抗體的手段。 之后又將cELISA與病毒中和試驗和免疫熒光抗體檢測進行對比，相比之下，cELISA 很容易實施，適合豬場的大規(guī)模檢測，并且成本便宜。

3 核酸檢測方法

3.1 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng) （RT-PCR） 首先將RNA 轉(zhuǎn)錄DNA中，再經(jīng)過PCR 反應(yīng)檢測細胞中RNA 病毒的含量。 范慧等[8]根據(jù)3D 基因設(shè)計引物，建立了診斷SVV 的RT-PCR 檢測手段。 劉濤等[9]基于口蹄疫的5’ -UTR 基因以及塞尼卡谷的VP1 基因設(shè)計引物，建立了口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的RTPCR 鑒別診斷方法。 RT-PCR 診斷方法敏感度高，特異性好，效率高且方便快捷，操作簡單，易于掌握。

3.2 實時熒光RT-PCR（qRT-PCR）

此方法基于RT-PCR，在PCR 過程中將熒光基團與cDNA混合，經(jīng)過熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR 過程。 最終，采用合適的數(shù)據(jù)分析法定量分析初始數(shù)據(jù)模板。 樊曉旭等[10]基于3D 基因區(qū)域設(shè)計和篩選出一組最佳引物和探針，建立了TaqMan 實時熒光PCR 檢測方法，得出qRT-PCR 敏感度和效率遠高于RT-PCR 的結(jié)論。 qRT-PCR 能迅速穩(wěn)定的檢測出SVV，而且污染少，操作簡便，能實時監(jiān)控。

3.3 反轉(zhuǎn)錄液滴數(shù)字PCR（RT-ddPCR）

反轉(zhuǎn)錄液滴數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)是最近幾年興起的病毒檢測技術(shù)。 Zhou[11]等選擇高度保守區(qū)域3D 基因設(shè)計了RT-ddPCR 引物和TaqMan 探針，建立了一種依賴線性曲線，只通過泊松分布公式計算直觀結(jié)果的SVV 檢測方法。 該檢測方法靈敏度比實時PCR 高，準確度和重復(fù)性也很好，而且成本較低，能實現(xiàn)絕對定量分析。

4 重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)

重組酶聚合酶等溫擴增是在常溫條件下進行核酸擴增。Piepenburg 等[12]將RPA 與實時熒光檢測方法和測流層析試紙條相結(jié)合建立了兩種檢測RPA 產(chǎn)物的方法。

4.1 重組酶聚合酶擴增-實時熒光（real-time-RPA） 檢測方法

樊曉旭[13]等針對3D 基因設(shè)計和篩選出合適的引物進行熒光定量PCR 反應(yīng)，建立了一種高效的SVV real-time-RPA 檢測方法。 該方法結(jié)合重組酶聚合酶等溫擴增和實時熒光反應(yīng)，不僅能實時監(jiān)控反應(yīng)過程，而且方便快捷，節(jié)約成本和能量，也能在實驗室外操作。

4.2 重組酶聚合酶擴增-測流層析試紙條（RPA-LFD） 檢測方法

樊曉旭[14]等對比3D 基因序列設(shè)計了引物和探針，建立起結(jié)合重組酶聚合酶擴增結(jié)合流動色譜條 （RPA-LFD） 的SVV檢測方法。 該方法不依賴任何設(shè)備，對感染SVV 的豬群能快速診斷，為控制病情、進行治療提供很大幫助。

5 結(jié)語

綜上所述，SVV 的危害雖然沒有口蹄疫病毒病大，但由于其分子結(jié)構(gòu)和引發(fā)的臨床特征相似，也給養(yǎng)殖場和技術(shù)人員帶來一定的麻煩和經(jīng)濟損失。 特別是最近幾年越來越多有關(guān)SVV疫情的報道，引起高度重視。 但到目前為止仍未開發(fā)出可用的疫苗，為了有效控制疫情的擴散和傳播，急需建立準確度高且方便快捷的診斷方法。 本文對SVV 的分子結(jié)構(gòu)和臨床特征進行簡略介紹，并總結(jié)SVV 的診斷方法，為后續(xù)研究、預(yù)防和治療SVV 病提供參考。