新城疫病毒F 蛋白B 細(xì)胞抗原表位鑒定

趙月兵 王東 王鐵菊 馬學(xué)忠

（河南省南陽市動物疫病預(yù)防控制中心 473000）

1 新城疫（ND）

新城疫是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一種急性、高度致死性的禽類傳染病，被國際獸疫局（Office International des Epizooties，OlE） 列為對畜禽危害最大的A 類傳染病之一。自1926 年從印度尼西亞爪哇分離到NDV以來，在世界上已發(fā)生了4 次ND 大流行，造成了巨大的經(jīng)濟損失。ND 也是一直嚴(yán)重危害我國養(yǎng)禽業(yè)的疫病之一，但由于疫苗的廣泛使用，此病己基本得到較好控制，近年來ND 的流行出現(xiàn)了以下新特點。

（1） 免疫雞群發(fā)生雞新城疫流行。經(jīng)過多次免疫的雞群仍然發(fā)生本病，多發(fā)生在二免與三免之間。造成免疫失敗的主要原因是現(xiàn)行疫苗越來越不足以抵擋野毒的侵襲。

（2） 病雞群出現(xiàn)亞臨床癥狀或非典型癥狀，主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀和神經(jīng)癥狀，產(chǎn)蛋雞主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋量下降。由于病雞常出現(xiàn)呼吸困難、甩頭、張口呼吸等癥狀，與其他一些呼吸道疾病如傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎、慢性呼吸道病等病的癥狀十分相似，給本病診斷增加了難度。

（3） 低發(fā)病率和低死亡率。目前出現(xiàn)的雞新城疫發(fā)病率一般在10%～25%，死亡率在15%～35%，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率下降30%左右。

（4） 剖檢病變不明顯。典型雞新城疫病變明顯部分表現(xiàn)在腺胃黏膜、肌胃角質(zhì)膜下出血，腸黏膜出血，盲腸扁桃體腫大、壞死、出血。目前經(jīng)過免疫的雞群發(fā)生雞新城疫時多數(shù)無上述明顯病變，有的只有十二指腸、直腸泄殖腔黏膜有出血點，腺胃、肌胃基本無病變。

（5） 雞群發(fā)生雞新城疫時多繼發(fā)大腸桿菌病。

本項鑒定應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析NDVF 蛋白生物學(xué)特性、一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)特性，應(yīng)用多肽合成技術(shù)、基因工程技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)，通過合成全部覆蓋F 蛋白一級結(jié)構(gòu)序列的重疊多肽，結(jié)合F 蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)分析、鑒定F 蛋白的B 細(xì)胞抗原表位譜。為全面認(rèn)識機體免疫系統(tǒng)對NDV 的識別規(guī)律，探討體液免疫系統(tǒng)抵抗NDV 感染的本質(zhì)提供重要的理論依據(jù)。同時，通過全面認(rèn)識和定位NDV 的B 細(xì)胞抗原表位譜為新型、高效、安全、營養(yǎng)的新型疫苗設(shè)計和病毒抗體檢測提供特異性的參考靶點。傳統(tǒng)疫苗由于成分復(fù)雜，在引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的同時，還刺激機體產(chǎn)生針對非特異性蛋白的大量無關(guān)抗體，大大消耗了機體免疫系統(tǒng)的資源，致使免疫系統(tǒng)不能最大化的充分發(fā)揮有效作用。傳統(tǒng)檢測NDV 病毒抗體的方法為HI 實驗，該方法不僅操作煩瑣，還不能準(zhǔn)確反映血清抗體中和性，本項研究通過NDV 中和性抗原表位的鑒定，為篩選檢測血清中和性抗體的候選表位抗原，設(shè)計NDV 血清抗體檢測的多肽-ELISA 檢測方法奠定基礎(chǔ)，為疫苗免疫效果評價和最佳免疫時間確定提供技術(shù)依據(jù)。另外，通過全面認(rèn)識和定位NDVB 細(xì)胞抗原表位可以了解該病毒抗原變異規(guī)律。揭示其免疫保護(hù)和免疫逃逸的規(guī)律。最后，NDVB 細(xì)胞抗原表位的鑒定對進(jìn)一步研究動物機體體液免疫的啟動規(guī)律具有重要的指導(dǎo)意義。

2 本鑒定的創(chuàng)新點有

（1） 詳細(xì)地繪制NDV F 蛋白的B 細(xì)胞抗原表位圖譜。證明F 蛋白中含有4 個中和性單克隆抗體識別的線性表位： EP1：36TLRSETSTYNLTV48；EP2： 66SNGNYKF72；EP3： 210DRPRVYTITAADDYQFS226；EP4： 316SWSARGSLAVTI327 和5個多抗反應(yīng)位點： ES1： 81NLPASYNYCRLVSRSLTV98；ES2：311GSLAVTIHGGNYPGALRPVTLV332；ES3： 341FELIPNPELA KNLVTEYG358；ES4： 403NSPLKIAGAFGFK415；ES5： 409RA IRRIAVPVVS420。

（2） 應(yīng)用單克隆抗體識別的表位多肽187CDSSDRPRVYTIT199 和337WSARGSLAVTIHG349 與載體蛋白KLH 偶聯(lián)后，免疫小鼠能產(chǎn)生針對其多肽本身的抗體，該抗體能在雞胚成纖維細(xì)胞上中和雞NDV 血清I 型病毒的增殖。

（3） 對揭示NDV 體液免疫發(fā)生的本質(zhì)具有重要意義，同時為設(shè)計ND 新型表位疫苗奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本鑒定結(jié)合現(xiàn)實生產(chǎn)，技術(shù)路線正確，鑒定方法先進(jìn)，設(shè)計合理，資料完整詳實，數(shù)據(jù)可靠，已達(dá)到同類鑒定的國內(nèi)領(lǐng)先水平，具有較大的學(xué)術(shù)理論價值和應(yīng)用前景。