影響瓜類作物未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)的幾個因素

王文英，劉喜存，郭春江，宋微微，董彥琪，馬曉紅

（1.河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.山東省種子管理總站，山東 濟南 250013）

瓜類作物較難在自然條件下產(chǎn)生單倍體，國內(nèi)外主要通過原位雌核發(fā)育、離體雄核發(fā)育和離體雌核發(fā)育途徑獲得單倍體植株。未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)屬于離體雌核發(fā)育途徑，是將未授粉子房或胚珠從母體上分離出來，在無菌的環(huán)境下接種到合適的培養(yǎng)基上進而發(fā)育成單倍體胚、植株的過程。利用該技術(shù)可有針對性地篩選出符合目標性狀的材料，并迅速獲得純系材料，縮短育種年限；因此，節(jié)省大量的人力和物力，提高了育種效率。未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)在植物遺傳學研究、育種實踐中具有很高的利用價值，可為植物育種研究奠定堅實的理論基礎[1]。

國內(nèi)外眾多學者研究表明，影響瓜類作物未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)的因素很多，本文針對以下幾個主要因素進行綜合性論述：植株的基因型、植株的生長季節(jié)、胚囊發(fā)育時期、低溫預處理、熱激處理、接種方式、培養(yǎng)基類型等。

1 影響瓜類作物未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)的因素

1.1 植株的基因型

植株的基因型對植物未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)有重要的影響。大量植物的離體雌核發(fā)育研究表明，不同供體材料中不同基因型之間即使在相同的培養(yǎng)條件下發(fā)育結(jié)果也有所不同。Li等[2]研究發(fā)現(xiàn)，采用雜交組合后代為材料的誘導效果比定型品種的效果要好。陳小鵬等[3]、徐靜[4]分別以黃瓜、西葫蘆的未授粉子房或胚珠為材料進行離體培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同基因型對未授粉子房或胚珠的離體培養(yǎng)效果影響不同。謝冰[5]在西葫蘆雌核離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)基因型不同導致離體雌核發(fā)育誘導率存在明顯的差異。劉栓桃等[6]對9個不同基因型西葫蘆材料的未授粉胚珠誘導培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，其雌核離體培養(yǎng)存在明顯的基因型差異，再生植株率最高的能達到33.33%，而最低的僅為2.67%。Shalaby[7]對12種不同基因型南瓜品種的未授粉雌花子房培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，不同材料的胚誘導率、成苗率都存在著較大的差異。杜勝利等[8]以生長在同一春季大棚中的“津春3號”和“津雜2號”黃瓜品種為試材，取未受精子房進行離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)“津春3號”的胚芽和愈傷誘導率均高于“津雜2號”。Ficeadenti等[9]研究了2個甜瓜品種及其雜交種的未授粉雌花子房培養(yǎng)，結(jié)果表明品種的出胚率較雜交種的出胚率高。周林[10]研究表明，6種基因型的西瓜未受粉子房愈傷組織誘導發(fā)生率存在明顯差異。

從以上試驗可以看出，基因型是影響未授粉子房胚胎發(fā)生的重要因素之一，有時甚至是決定因素，選擇合適的基因型是植物未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。

1.2 供體植株的生長季節(jié)

供體植株的生長季節(jié)對未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)的影響也是十分顯著的，這可能與植株的生理生長特性有關(guān)。魏愛民等[11]研究了在不同生長季節(jié)，黃瓜離體雌核發(fā)育的單倍體胚胎發(fā)生率和植株再生率的區(qū)別，結(jié)果表明：在溫度相對較高的6月下旬、7月上旬以及9月份其培養(yǎng)效果要明顯高于其他月份。在生長發(fā)育前期，供體植株單倍體再生率相對較高且穩(wěn)定，但隨著供體植株逐漸衰老，其未受粉子房培養(yǎng)的污染率不斷上升，同時發(fā)現(xiàn)種植于塑料大棚內(nèi)的供體材料比種植在露地中的供體材料具有更高的單倍體胚胎發(fā)生率和成苗率。盛慧[12]研究結(jié)果表明，秋季生長的黃瓜材料誘導率要高于春季，且不易污染，而冬季的誘導效果則一般。Przyboromwski等[13]在黃瓜單倍體誘導中發(fā)現(xiàn)，春季材料的誘導率很低，僅是夏季材料誘導率的1/4。謝冰[5]研究發(fā)現(xiàn)，不同播期的西葫蘆材料的胚狀體發(fā)生率存在極顯著差異，秋播材料的誘導率最高，夏播與春播的誘導率都很低。陳解放[14]、孫守如等[15]在南瓜上的試驗結(jié)果也證實胚狀體發(fā)生和小苗的誘導集中在7月中旬和8月中旬。

綜上可見，不同植物的胚狀體誘導率在不同季節(jié)呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，選取合適季節(jié)的供體可大大提高其誘導率。

1.3 胚囊發(fā)育時期

不同作物種類、品種間胚囊發(fā)育時期對離體雌核發(fā)育的影響存在差異。陳學軍等[16]認為，處于成熟胚囊期即開花當天的西葫蘆未受精子房的胚狀體、愈傷組織誘導率、再生植株率最高。劉栓桃等[6]對不同西葫蘆材料進行不同開花時期取材試驗，結(jié)果表明開花當天的胚珠最適合誘導培養(yǎng)，再生植株發(fā)生率最高。葛志東等[17]認為開花前1 d的西葫蘆未受精胚珠誘導再生植株率最高，其次為開花當天，開花前2 d的胚珠誘導再生植株率最低。陳解放[14]研究表明，開花當天的南瓜未受精子房的胚狀體誘導率、成苗率均最高，這可能是花器內(nèi)源激素在開花當日達到較高水平的緣故。孫守如等[15]發(fā)現(xiàn)，開花前1 d的南瓜胚珠已成熟或接近成熟，誘導率較高。韓麗華[18]對胚囊發(fā)育途徑做切片觀察，發(fā)現(xiàn)厚皮甜瓜開花前14 h胚囊處于接近成熟胚囊的狀態(tài)，經(jīng)熱激和硝酸銀誘導，可使卵器細胞繼續(xù)分裂，胚囊內(nèi)卵器分裂形成胚狀體，萌發(fā)形成單倍體植株。在刁衛(wèi)平等[19]的黃瓜試驗中發(fā)現(xiàn)，開花前1～4 d的子房均可誘導獲得胚芽，但以開花前2～3 d的子房胚芽誘導率最高。

從以上試驗可以看出，胚囊發(fā)育時期對胚狀體的誘導至關(guān)重要，不能僅憑開花時間來判斷胚囊發(fā)育時期，不同材料在不同的開花時期所處的胚囊發(fā)育時期也不盡相同，試驗材料的播種時期、雌花的發(fā)育時期及雌花的部位等對胚誘導頻率都有著重要的影響[20]。

1.4 接種前外植體的預處理

1.4.1 低溫處理

低溫預處理是花藥培養(yǎng)中比較常見的培養(yǎng)方法。祝仲純等[21]認為，在單倍體培養(yǎng)過程中，需要先對外植體進行一定的預處理或預培養(yǎng)，如低溫處理、高溫熱激處理、黑暗處理等，使植株或外植體細胞的生理生化狀態(tài)、細胞分裂方式或細胞發(fā)育狀態(tài)發(fā)生一定的改變，從而提高愈傷組織誘導率、單倍體植株再生率。Kwack等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，南瓜胚珠在5 ℃冷處理2 d后，其體細胞胚的再生頻率得到了提高。低溫預處理極有可能改變雌核發(fā)育途徑，從而導致單倍體胚形成。

1.4.2 熱激處理

熱激處理溫度對愈傷組織或胚狀體的形成以及促進其生長都有重要作用。陳小鵬等[3]發(fā)現(xiàn)，黃瓜未受精子房誘導胚狀體的最佳預處理溫度為35 ℃。Shalaby[7]研究表明南瓜品種“Queen F1”在32 ℃熱激處理4 d時效果最佳。葛志東等[17]研究顯示，35 ℃熱激處理5 d能夠有效啟動西葫蘆雌核發(fā)育，提高離體雌核發(fā)生率。徐靜[4]也發(fā)現(xiàn)，35 ℃熱激處理5 d對大多數(shù)西葫蘆品種的子房培養(yǎng)有效，可明顯地促進葫蘆科植物的雌核發(fā)育。Diao等[23]研究表明，在35 ℃條件下對黃瓜的離體雌核進行熱激處理3 d的誘導率比熱激處理2、4 d的效果好?？梢姡蠖鄶?shù)植物的最佳預處理溫度均為35 ℃，不同的植物預處理的天數(shù)有所不同。

1.5 接種方式

植物材料的接種方式直接影響到離體雌核對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率，從而影響雌核的發(fā)育。陳學軍等[16]比較了4種接種方法對愈傷組織誘導率的影響，發(fā)現(xiàn)橫切分法接種的胚珠最先長出愈傷組織，誘導率最高達28%。杜勝利等[8]發(fā)現(xiàn)，將黃瓜未授粉子房切成2～3 mm的薄片平放接種在離體培養(yǎng)基上的誘導效果最佳。周林[10]也發(fā)現(xiàn)，切片法使西瓜胎座組織與培養(yǎng)基接觸面積增大，促進充分吸收營養(yǎng)，生長旺盛。這可能是因為橫切分法造成外植體產(chǎn)生較大的創(chuàng)傷面，使其對養(yǎng)分的吸收能力得到提高，從而激發(fā)外植體形成愈傷組織。

1.6 培養(yǎng)基

目前，在多數(shù)研究報道中，研究人員使用MS或改良MS培養(yǎng)基進行瓜類作物未授粉子房或胚珠的離體培養(yǎng)。陳學軍等[16]采用MS培養(yǎng)基進行西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)。謝冰[5]采用N6培養(yǎng)基進行西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)，認為培養(yǎng)基對西葫蘆胚狀體誘導頻率影響較大，篩選的M3、M2培養(yǎng)基有較大的利用價值。此外，韓麗華[18]也使用MS培養(yǎng)基進行厚皮甜瓜的離體雌核誘導試驗。

2 問題與展望

前人已在黃瓜、西葫蘆、西瓜、甜瓜、南瓜等瓜類作物上應用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)技術(shù)，并獲得了單倍體胚和單倍體植株，為研究離體雌核發(fā)育機制，開展更廣泛的未授粉胚珠、單倍體培養(yǎng)方法奠定了基礎。瓜類離體雌核發(fā)育、胚狀體的形成及成苗過程涉及的影響因素更為復雜，還存在許多亟待解決的問題，如建立高效穩(wěn)定的誘導體系、快速鑒定多倍體的倍性以及在組織、器官、細胞及分子水平的生長發(fā)育機理等。

國內(nèi)外眾多學者利用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)技術(shù)在不同的瓜類作物上已做了不少的研究工作，也在基因型、胚囊發(fā)育時期、接種方式、植株生長季節(jié)、植物生長調(diào)節(jié)劑、低溫預處理、熱激處理等方面做了大量的研究和探索，發(fā)現(xiàn)上述影響因素并不是孤立存在的，而是由多種因素共同作用、相互影響、協(xié)同作用；因此，植物未授粉子房或胚珠等離體雌核培養(yǎng)尚需大量的后續(xù)研究工作以逐漸完善該技術(shù)。