多重復(fù)合誘變選育金霉素高產(chǎn)菌株

蔡玉鳳

摘 要： 為提高金色鏈霉菌產(chǎn)金霉素水平，增大突變多樣性，研究常壓室溫等離子體（ARTP）、紫外線與氯化鋰復(fù)合誘變對(duì)構(gòu)建金色鏈霉菌突變庫的影響。結(jié)合前體物及高濃度產(chǎn)物耐受性確定篩選模型，通過初篩及搖瓶復(fù)篩，選育獲得2株菌落形態(tài)特性改變、金霉素效價(jià)較出發(fā)菌株提高20%以上，且其高效價(jià)特性穩(wěn)定的高產(chǎn)金霉素突變菌株?；诙嘀貜?fù)合誘變和前體/產(chǎn)物耐受構(gòu)建了高產(chǎn)菌株選育模型，不僅突變庫的多樣性更高，而且簡便快捷，提高了篩選效率，并減少篩選工作量，對(duì)金霉素及其他鏈霉菌來源抗生素的生產(chǎn)成本降低和產(chǎn)能提高都具有一定的應(yīng)用價(jià)值和指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞： 金霉素;常壓室溫等離子體誘變;耐受性;復(fù)合誘變;篩選

中圖分類號(hào)： R978文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)： 0253-2301（2020）06-0001-06

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.06.001

Breeding of High-yield Aureomycin Strain by Multiple Complex Mutagenesis

CAI Yu-feng

（Fuzhou Industrial Microorganism Technology Co.， Ltd.， Fuzhou， Fujian 350007， China）

Abstract：In order to improve the production level of aureomycin by? Streptomyces aureus? and increase the diversity of mutations， the effects of atmospheric pressure room temperature plasma （ARTP）， ultraviolet radiation and lithium chloride mutagenesis on the construction of the mutant library of streptomyces aureus were studied. The screening model was established by overcoming the tolerance of precursors and a high concentration of products. Then， after the primary screening and shake flask re-screening， two mutant strains with high yield of aureomycin and stable high potency were selected， of which the colonial morphological characteristics were changed and the aureomycin potency was increased by more than 20% compared with the original strain. Based on the multiple complex mutagenesis and precursor/product tolerance， the screening model of high-yield strains was established， which not only increased the diversity of the mutant library， but also improved the screening efficiency and reduced the screening workload. It had certain application value and guiding significance for reducing the production cost and increasing the production capacity of aureomycin and other antibiotics from streptomyces.

Key words：Aureomycin; ARTP mutation; Tolerance; Complex mutagenesis; Screening

金霉素chlortetracycline分子式為C 22 H 23 ClN 2O 8，分子量478.88，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，是由金色鏈霉菌 Streptomyces aureofaciens 發(fā)酵產(chǎn)生的四環(huán)素類廣譜抗生素。金霉素以其抑菌、促生長、飼料利用率高、在肌體內(nèi)殘留量低的特點(diǎn)以及其生產(chǎn)技術(shù)成熟和生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，成為在飼料工業(yè)中用量最大的抑菌促生長劑[1] 。金色鏈霉菌是重要的藥用微生物，屬于高度好氣、革蘭氏陽性放線菌。然而，目前金霉素生產(chǎn)菌株產(chǎn)金霉素水平相對(duì)較低（金霉素發(fā)酵效價(jià)常在 18 000 μg·mL-1 左右）[2] ，嚴(yán)重影響了生產(chǎn)效益。

抗生素的高產(chǎn)菌株誘變育種方法包括物理或化學(xué)誘變[3] 、原生質(zhì)體誘變[4-5] 等，程序簡單，突變類型豐富，被廣泛應(yīng)用于科研及生產(chǎn)領(lǐng)域高產(chǎn)菌株的選育。但是金色鏈霉菌經(jīng)過多次傳統(tǒng)誘變，經(jīng)常出現(xiàn)誘變效率低、負(fù)變率高、易回復(fù)突變等現(xiàn)象，且反復(fù)誘變常產(chǎn)生誘變飽和效應(yīng)，使產(chǎn)量難以提高。與傳統(tǒng)常規(guī)誘變方法相比，常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變系統(tǒng)具有操作簡便、設(shè)備簡單、條件溫和、安全性高、誘變快速、產(chǎn)生突變的多樣性大等特點(diǎn)，已成功應(yīng)用于細(xì)菌、藻類、真菌、放線菌等多種微生物的菌種選育，并篩選到高產(chǎn)突變株[6-10] 。紫外線誘變中加入誘變劑氯化鋰可以提高誘變效率，誘變效果更好[11] 。常壓室溫等離子體、紫外線和氯化鋰復(fù)合處理金色鏈霉菌，誘變損傷更多樣化，其誘變效應(yīng)顯著，獲得比單一誘變更多的突變類型，從而增加誘變庫的多樣性，大大提高獲得高產(chǎn)突變株的概率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 金色鏈霉菌菌株FJ0084（由工業(yè)微生物教育部工程研究中心保藏提供）。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面及固體平板培養(yǎng)基：麩皮30g·L-1 ，硫酸鎂0.01g·L-1 ，磷酸二氫鉀0.01g·L-1 ，磷酸氫二胺0.03g·L-1 ，瓊脂20g·L-1 ，pH自然。

種子培養(yǎng)基： 玉米淀粉30g·L-1 ，花生餅粉10g·L-1 ，黃豆餅粉15g·L-1 ，酵母粉5g·L-1 ，硫酸銨4g·L-1 ，碳酸鈣4g·L-1 ，氯化鈉3g·L-1 ，硫酸鎂0.1g·L-1 ，磷酸二氫鉀0.1g·L-1 ，豆油0.8g·L-1 ，pH自然，裝量為25 mL三角瓶（250 mL）。

發(fā)酵培養(yǎng)基： 玉米淀粉80g·L-1 ，花生餅粉30g·L-1 ，玉米粉20g·L-1 ，蛋白胨15g·L-1 ，黃豆餅粉15g·L-1 ，玉米漿8g·L-1 ，酵母粉3g·L-1 ，碳酸鈣5g·L-1 ，氯化鈉3.4g·L-1 ，硫酸銨4g·L-1 ，硫酸鎂0.2g·L-1 ，磷酸二氫鉀0.1g·L-1 ，淀粉酶0.02g·L-1 ，豆油25g·L-1 ，pH自然，裝量為25 mL三角瓶（250 mL）。

1.1.3 單孢子懸液制備 將培養(yǎng)好的金色鏈霉菌斜面加入20 mL無菌水，輕輕刮下成熟孢子，倒入帶有玻璃珠的100 mL三角瓶中振搖20 min，制備濃度 107～ 108 個(gè)·mL-1 單孢子懸液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金色鏈霉菌FJ0084的培養(yǎng)方法 斜面活化培養(yǎng)：接種后于34℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4 d;搖瓶種子培養(yǎng)：培養(yǎng)好的菌株斜面加入5 mL無菌水，刮下成熟孢子，制備得孢子懸液，接種1 mL至25 mL種子培養(yǎng)基中，30℃、270r·min-1 培養(yǎng)22 h;搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：以10%的移種量移入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、270r·min-1 培養(yǎng)6 d。

1.2.2 金霉素耐受性試驗(yàn) 制備不同濃度金霉素耐受性種子培養(yǎng)基，終濃度為0、 2 000 、 3 000 、 4 000 、 5 000 μg·mL-1 ，將金色鏈霉菌的單孢子菌懸液接種于金霉素耐受性種子培養(yǎng)基，30℃、270r·min-1 培養(yǎng)16 h，然后稀釋涂布于平板34℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)并計(jì)算菌落數(shù)。

1.2.3 NaCl耐受試驗(yàn) 大多數(shù)微生物在0.5%～3.0%的鹽濃度范圍內(nèi)可正常生長[12] ，為提高金色鏈霉菌對(duì)前體物的耐受性，制備濃度0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的NaCl平板，將金色鏈霉菌的單孢子菌懸液稀釋涂布于NaCl平板，34℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)并計(jì)算菌落數(shù)。

1.2.4 ARTP誘變處理 ARTP誘變儀設(shè)置：以氦氣作為工作載氣，設(shè)定功率為110 W，工作氣量10 SLM。取900 μL單孢子懸液，加入100 μL 50%甘油，充分混勻后吸取10 μL均勻涂在載片上，使孢子懸液均勻覆蓋在載片的表面，處理時(shí)間梯度設(shè)為0、20、40、60、80、100、120 s。處理結(jié)束后將載片上的孢子全部洗脫下來，適當(dāng)梯度稀釋后并取100 μL涂布于平板培養(yǎng)基，每組3個(gè)平行，

34℃避光培養(yǎng)5 d，通過平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，繪制致死率曲線。

1.2.5 紫外線 LiCl復(fù)合誘變 取單孢子懸液于無菌培養(yǎng)皿中（每皿加5 mL），在磁力攪拌器攪拌下，置于30 cm處，功率20 W的紫外燈下，照射時(shí)間為0、10、20、30、40、50、60 s。適當(dāng)梯度稀釋后涂布至含有1.0% LiCl的分離平板上，每組3個(gè)平行，34℃避光培養(yǎng)5 d，通過平板菌落計(jì)數(shù)，繪制致死率曲線。

1.2.6 ARTP 紫外線 LiCl復(fù)合誘變 將單孢子菌懸液進(jìn)行ARTP誘變處理后再進(jìn)行紫外線誘變，接種于金霉素耐受性種子培養(yǎng)基，30℃、270r·min-1 培養(yǎng)8 h，進(jìn)行適當(dāng)梯度稀釋后涂布至含有1.0% LiCl和2.0% NaCl的分離平板上，每組3個(gè)平行，34℃避光培養(yǎng)5 d，挑取單菌落，通過搖瓶發(fā)酵，計(jì)算致死率和突變率。

1.2.7 高產(chǎn)菌的發(fā)酵篩選 根據(jù)菌落生長的形態(tài)、顏色、大小和背部色素，挑取單菌落，按1.2.1方法培養(yǎng)，6 d后按1.3.1方法測定其效價(jià)，從初篩高于對(duì)照10%以上的突變菌株中進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，每批3個(gè)平行樣，選取搖瓶效價(jià)高、發(fā)酵穩(wěn)定的菌株進(jìn)行保藏傳代。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)誘變復(fù)篩后的高產(chǎn)突變株傳5代，按1.2.1方法培養(yǎng)發(fā)酵，6 d后按1.3.2方法測定其效價(jià)，主要考察突變株孢子的外觀及發(fā)酵水平的穩(wěn)定性。

1.3 測定方法

1.3.1 化學(xué)法測定金霉素效價(jià) 化學(xué)測定法的原理是根據(jù)金霉素在酸性溶液中加熱脫去一分子水，生成黃色的脫水金霉素，其比色度與含量成正比，此性質(zhì)符合比爾定律，因此用比色法來測定金霉素的效價(jià)[13] 。取10 g發(fā)酵液經(jīng)草酸酸化過濾后，分別吸取0.1 mL濾液和5 mL 2mol·L-1 鹽酸溶液于2個(gè)100 mL容量瓶中，一份作為空白對(duì)照，另一份于沸水浴中加熱5 min，冷卻后加蒸餾水定容至刻度，搖勻后于440 nm波長測定吸光值，將吸光值代入公式（1）中計(jì)算發(fā)酵液效價(jià)。

效價(jià)（μg·mL-1 ）= A-b k × V2 V1 （1）

式中， b 為金霉素工作曲線回歸方程中的截距; k 為金霉素工作曲線回歸方程中的斜率; A 為測得的吸光值; V 1為吸樣體積; V 2為容量瓶體積。

1.3.2 HPLC法測定金霉素效價(jià) 參照中國藥典2005年版第二部金霉素的高效液相色譜測定法[14] ，色譜柱：C8（75 mm×4.6 mm，3.5 μm），柱溫45℃;檢測波長為280 nm，流速：0.4mL·min-1 ;流動(dòng)相∶ 高氯酸∶ 二甲亞砜∶ 水（8∶525∶ 467） 為流動(dòng)相（pH<2.0）;流速為1.0mL·min-1 ;發(fā)酵液樣品處理參照化學(xué)測定法處理，根據(jù)估計(jì)效價(jià)將濾液適當(dāng)稀釋后取10 μL進(jìn)樣測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 金霉素耐受性選擇試驗(yàn)

金霉素作為金色鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，產(chǎn)量與其對(duì)終產(chǎn)物的耐受性有關(guān)，因此取其產(chǎn)物鹽（金霉素鹽酸鹽）為底物，用于高耐受突變株的選育。金色鏈霉菌在不同濃度的金霉素耐受性培養(yǎng)基上的生長情況如表1所示，隨著金霉素濃度的增大，金色鏈霉菌單菌落數(shù)逐漸減少，生長緩慢產(chǎn)孢少;金色鏈霉菌在對(duì)照平板培養(yǎng)基的菌落形態(tài)如圖2a所示，圖2b、2c、2d、2e分別為2 000、3 000、 4 000 、5 000μg·mL-1 金霉素耐受性培養(yǎng)基上金色鏈霉菌的菌落形態(tài)。由于鹽酸金霉素的室溫溶解度只有 8 600 μg·mL-1 ，只能過濾除菌，且不可高溫滅菌，金霉素耐受性培養(yǎng)基終濃度最多增大到 5 000 μg·mL-1 。因此，金霉素耐受性選擇培養(yǎng)基耐受濃度設(shè)置為 5 000 μg·mL-1 作為后續(xù)篩選高產(chǎn)菌株的選擇壓力濃度。

2.2 NaCl耐受試驗(yàn)

氯離子為金霉素合成的前體物，因此從對(duì)氯離子耐受的突變株中獲得高產(chǎn)金霉素菌株的可能性更高。金色鏈霉菌在對(duì)照平板培養(yǎng)基的菌落形態(tài)如圖3a所示，隨著氯化鈉濃度的增大，金色鏈霉菌生長緩慢，菌落數(shù)減少，產(chǎn)孢少，菌落形態(tài)、顏色、大小也明顯受濃度影響，金色鏈霉菌在2.0% NaCl培養(yǎng)基上基本表現(xiàn)為4種菌落形態(tài)（圖3b、3c、3d、3e），圖3b形態(tài)菌落較小而突起，黑色，表面光滑;圖3c形態(tài)菌落黃褐色突起，表面光滑;圖3d形態(tài)菌落略有皺褶，白色菌絲;圖3e形態(tài)菌落較小，白色。當(dāng)氯化鈉濃度增加到3.5%時(shí)，只有4個(gè)透明小菌落，可能是高滲溶液的Na +離子影響了細(xì)胞和培養(yǎng)基的滲透壓，抑制了菌體生長繁殖。為便于挑選突變菌株，盡可能提高金色鏈霉菌對(duì)前體物 Cl - 離子的耐受性，因此選擇NaCl的耐受濃度為2.0%。

2.3 ARTP誘變處理

不同ARTP誘變處理時(shí)間對(duì)金色鏈霉菌致死情況如圖4所示，誘變40 s時(shí)致死率已達(dá)79.1%，當(dāng)誘變時(shí)間為120 s時(shí)已完全致死?，F(xiàn)代育種理論認(rèn)為，在更高的致死率下，雖然突變率可能較高，?但負(fù)突變率也很高，而正突變率卻很低，當(dāng)致死率在70%～80%時(shí)，產(chǎn)量性狀的正突變率較高[15] 。因此，致死率過高或過低都不利于突變菌株的篩選，為利于突變菌株的進(jìn)一步篩選，選擇誘變時(shí)間為 40 s。

2.4 紫外線 LiCl復(fù)合誘變處理

從圖5可以看出，金色鏈霉菌對(duì)紫外線非常敏感，在紫外線的作用下，照射時(shí)間越長，致死率越高，紫外線照射處理20 s，致死率就達(dá)到78.6%，而處理50 s，幾乎全部致死，為提高獲得高產(chǎn)菌株的概率，選擇紫外線照射時(shí)間為20 s。

2.5 ARTP 紫外線 LiCl復(fù)合誘變

將金色鏈霉菌單孢子菌懸液先通過ARTP誘變處理40 s后，進(jìn)行紫外線照射20 s，結(jié)合前體物及高濃度產(chǎn)物耐受性選育，每組3個(gè)平行，ARTP 紫外線 LiCl復(fù)合誘變致死率達(dá)到91.6%，挑取?2 355 株突變株，通過搖瓶發(fā)酵，進(jìn)行突變率的統(tǒng)計(jì)，金色鏈霉菌菌株正突變率達(dá)5.7%。

2.6 高效價(jià)菌株的發(fā)酵篩選

研究過程中發(fā)現(xiàn)菌落生長的形態(tài)、顏色、大小及背部色素對(duì)金色鏈霉菌的效價(jià)有一定的影響，因此通過前體物、高濃度產(chǎn)物耐受性選育，以及菌落形態(tài)的確定，可以建立簡便快捷且高效率的高產(chǎn)菌株篩選方法，為突變菌株的初篩提供依據(jù)。經(jīng)發(fā)酵復(fù)篩，獲得2株生長較好且效價(jià)高于對(duì)照20%以上的突變菌，結(jié)果見表2，其中FAL 065變株為淺綠色菌落，孢子較為飽滿，背部色素較深（圖6b）;FAU 083變株為鼠灰色銅錢狀菌落，中心有小孔，孢子飽滿（圖6c）。其中FAL 065變株的菌落顏色與出發(fā)菌株差異較大，說明重復(fù)合誘變方法確實(shí)使金色鏈霉菌損傷更多樣化，遺傳信息多樣性更好，產(chǎn)生了新的遺傳性狀，其誘變效應(yīng)顯著，且可以有效地篩選到高產(chǎn)菌株。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

為了確保篩選到的高產(chǎn)突變株具有遺傳穩(wěn)定性，對(duì)誘變選育后產(chǎn)量較高的菌株進(jìn)行傳代試驗(yàn)。共傳5代，每代做3個(gè)平行，結(jié)果如圖7所示。從第1代到第5代，F(xiàn)AL 065菌株產(chǎn)量平均為 20 274 μg·mL-1 ， T 值為 0.236 7 ，? P > 0.05表示差異性不顯著，且突變株孢子外觀性狀穩(wěn)定， FAU 083 菌株產(chǎn)量平均為 21 037 μg·mL-1 ， T 值為 0.168 8 ，? P > 0.05表示差異性不顯著，說明這兩株突變菌株遺傳穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

應(yīng)用常壓室溫等離子體（ARTP）、紫外線和氯化鋰對(duì)金色鏈霉菌進(jìn)行復(fù)合誘變處理，增大了突變的多樣性，結(jié)合前體物及高濃度產(chǎn)物耐受性選育，建立了簡便快捷且高效率的高產(chǎn)菌株篩選模型，提高篩選效率，減少篩選工作量。最終獲得2株金霉素效價(jià)較出發(fā)菌株提高20%以上、高效價(jià)且遺傳穩(wěn)定的菌株FAL 065、FAU 083，其中FAL 065變株為淺綠色菌落，孢子較為飽滿，背部色素較深，且性狀穩(wěn)定，產(chǎn)量平均為 20 274 μg·mL-1 ，F(xiàn)AU 083變株為鼠灰色銅錢狀菌落，中心有小孔，孢子飽滿，產(chǎn)量平均為 21 037 μg·mL-1 。本研究未能解除高滲溶液對(duì)菌體生長的影響，可尋找其他帶前體物Cl -的鹽溶液進(jìn)行耐受性選育。多重復(fù)合誘變方法損傷更多樣化，可以有效地篩選到高產(chǎn)菌株且遺傳穩(wěn)定，其誘變效應(yīng)顯著，這不僅對(duì)金色鏈霉菌，對(duì)其他產(chǎn)抗生素鏈霉菌的工業(yè)遺傳育種也同樣具有重要的參考價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）