N-6甲基腺嘌呤在免疫調(diào)控中的研究進展

夏 婭，樊丹平，肖 誠*

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100102；2.中日友好醫(yī)院 臨床研究所，北京 100029；3.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 研究生院，北京 100730）

作為遺傳物質(zhì)，核酸在生命系統(tǒng)中起著基礎性的作用。表觀遺傳修飾廣泛存在于DNA 和RNA 中，這表明核酸不僅是遺傳物質(zhì)，而且在各種生物過程中具有復雜的調(diào)節(jié)功能，從而在遺傳、生長和疾病等各方面都具有深遠的影響。RNA 的表觀遺傳修飾是核酸領域最重要的研究方向之一。迄今為止，已在所有生物體的RNA 中鑒定出100多種轉(zhuǎn)錄后修飾類型。各類RNA，包括信使RNA（mRNA），核糖體RNA（rRNA），轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）都可以發(fā)生甲基化修飾。人們開始認識到RNA 中除了基本的A、U、C 和G 之外，還存在被修飾的核苷。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）是大多數(shù)真核細胞mRNA 中最普遍和最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾。在從哺乳動物體內(nèi)分離得到的RNA 中，約有0.1%～0.4%的腺嘌呤是含有m6A 修飾的，占總甲基化核糖核苷酸的50%左右。m6A 修飾主要發(fā)生在RRACH（R 表示A 或G，H 表示A、C 或U）基序上，且明顯聚集在終止密碼子和3' 非翻譯區(qū)（3'UTR）周圍[1]。

m6A 修飾在哺乳動物細胞分化、胚胎發(fā)育等生物學過程以及多種疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本文將綜述m6A 修飾在免疫調(diào)控中的作用及研究進展。

1 m6A 修飾的調(diào)控與動態(tài)平衡

m6A 修飾是一個動態(tài)可逆的過程。在人體內(nèi)，要維持m6A 含量的動態(tài)穩(wěn)定，需要多種酶的共同參與，主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶。為了更好地描述，人們形象地將甲基轉(zhuǎn)移酶稱為編碼器（writer），去甲基化酶稱為消碼器（eraser）。經(jīng)m6A 修飾后的RNA 在讀碼器（reader）的作用下，將信息傳遞給下游，發(fā)揮對mRNA 的調(diào)控作用。

1.1 編碼器

m6A 甲基化由甲基轉(zhuǎn)移酶復合物催化進行。該復合物主要由甲基轉(zhuǎn)移酶3（methyltransferase-like 3，METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶14（methyltransferase-like 14，METTL14）和Wilms 瘤相關(guān)蛋白（Wilms tumor 1 associated protein，WTAP）共同構(gòu)成。METTLE3 最早于1997年在HeLa 細胞中被發(fā)現(xiàn)，具有SAM 結(jié)合域，是首個被鑒定為編碼器成員的蛋白。METTL14 具有2 個保守的功能域：一個參與催化甲基化反應；另一個是調(diào)控蛋白相互作用。METTL3 和METTL14 彼此緊密結(jié)合，催化甲基轉(zhuǎn)移到腺苷。WTAP 不具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，其本身對m6A 甲基化沒有催化活性。但它與METTL3 和METTL14 復合物相互作用，影響體內(nèi)催化m6A 進行甲基化的酶的活性[2]。隨著研究的深入，更多的甲基轉(zhuǎn)移酶復合物成員被發(fā)現(xiàn)。

1.2 消碼器

脂肪組織與肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO）是第一個被鑒定的去甲基化酶，它的發(fā)現(xiàn)表明m6A 甲基化是一種動態(tài)可逆的RNA 修飾。α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶同源物5（α-ketoglutarate-dependent dioxygenasehomolog 5，ALKBH5） 是第二個被鑒定的RNA去甲基化酶。FTO 和ALKBH5 均屬于α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶家族，以Fe2+和α-酮戊二酸的化學方式催化m6A 去甲基化。據(jù)報道，F(xiàn)TO 和ALKBH5 具有明顯的組織特異性和多樣的細胞內(nèi)定位。FTO 在脂肪和腦組織中高度豐富，而ALKBH5 在睪丸中高表達[3]。此外，最近的研究還發(fā)現(xiàn)了另一種m6A 去甲基化酶，即ALKBH3。但是ALKBH3 更傾向作用于tRNA 中的m6A，而不是mRNA 或rRNA 中的m6A[4]。

1.3 讀碼器

編碼器和消碼器的作用是在靶RNA 的特定結(jié)構(gòu)域上安裝或去除m6A，改變其二級或三級結(jié)構(gòu)，而讀碼器的作用是識別并優(yōu)先結(jié)合靶RNA。為了使m6A 修飾具有生物學功能，它需要被不同的讀碼器識別，以發(fā)揮不同的下游效應。

YT521-B 同源蛋白YTH（members of the YT521-B homology，YTH） 是目前發(fā)現(xiàn)的主要m6A 結(jié)合蛋白。YTHDF1 通過與起始因子相互作用來促進靶RNA 與核糖體結(jié)合，增強mRNA 翻譯和蛋白質(zhì)合成[5]。YTHDF2 通過選擇性結(jié)合m6A 修飾的mRNA，并將其募集到mRNA 衰減位點來誘導轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降解。有趣的是，YTHDF3 作用具有雙向性，與YTHDF1 相互作用時增強RNA 翻譯，而與YTHDF2 結(jié)合會促進RNA 降解[6]。YTHDC1 有助于RNA剪接和輸出。YTHDC2 可促進靶RNA 的翻譯效率[7]。此外，IGF2BPs、HNRNPC、EIF3 等讀碼器也陸續(xù)被確定。

2 m6A 甲基化修飾對RNA 結(jié)構(gòu)及功能的影響

2.1 m6A 修飾影響mRNA 剪接

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 被剪接形成成熟的轉(zhuǎn)錄本，再從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，最后被翻譯成蛋白質(zhì)。m6A 的編碼器、消碼器及讀碼器的定位表明m6A 對mRNA 剪接起調(diào)控作用。現(xiàn)已確定WTAP 是一種拼接因子，敲除WTAP 或METTL3 會產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本。FTO 通過各種作用導致mRNA 剪接發(fā)生變化。YTHDC1 通過募集和調(diào)節(jié)mRNA 前體剪接因子調(diào)節(jié)mRNA 剪接[8]。

2.2 m6A 修飾調(diào)節(jié)mRNA 穩(wěn)定性

m6A 修飾對mRNA 穩(wěn)定性的影響主要取決于與之結(jié)合的讀碼器。多項研究表明，m6A 修飾可降低RNA 穩(wěn)定性。敲除胚胎干細胞中的METTL3 和METTL14 可以降低m6A 水平，增強mRNA 穩(wěn)定性以減少mRNA 的衰變，從而導致靶mRNA 的表達增加，增強胚胎干細胞的自我更新能力以及維持胚胎干細胞的多能性。

2.3 m6A 修飾調(diào)控翻譯

mRNA 是翻譯的直接模板，m6A 通過多種機制對翻譯進行調(diào)控。通過募集mRNA 穩(wěn)定劑，IGF2BP 可保護目標mRNA 免受降解，同時有助于輸出到細胞質(zhì)后的翻譯[9]。YTHDF1 募集eIF3 以直接結(jié)合5'UTR 中的單個m6A，從而促進核糖體加載，并募集43S 復合體以促進翻譯[10]。在翻譯過程中，YTHDF3 與核糖體40S/60S 亞基相互作用，顯著提高了YTHDF1 和YTHDF3 靶向m6A 甲基化mRNA的翻譯效率[11]。但過多的m6A 修飾對翻譯產(chǎn)生負面影響。

3 m6A 在免疫調(diào)控中的作用

在編碼器、消碼器、讀碼器等關(guān)鍵蛋白的作用下，mRNA 上的m6A 修飾水平發(fā)生改變，從而影響其結(jié)構(gòu)和生物學功能，調(diào)控生物免疫系統(tǒng)。盡管m6A 甲基化修飾在不同細胞中對mRNA 的作用相似，但在多種免疫細胞及各種免疫類型中仍具有不同的功能。

3.1 m6A 修飾調(diào)控免疫細胞的穩(wěn)態(tài)平衡

免疫細胞的穩(wěn)態(tài)平衡對于維持機體健康至關(guān)重要。多項研究表明，m6A 修飾導致的mRNA 甲基化對維持T 細胞穩(wěn)態(tài)具有重要意義。T 細胞穩(wěn)態(tài)是維持T 細胞庫大小的重要因素，同時為適應性免疫奠定基礎。細胞因子信號抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）蛋白是JAK-STAT 信號通路的關(guān)鍵生理抑制劑，其家族成員SOCS1 是IL-7 信號的顯著負調(diào)節(jié)因子，SOCS3 和CISH 可抑制STAT5 磷酸化和T 細胞增殖。

研究發(fā)現(xiàn)[12]，METTL3 可影響SOCS1、SOCS3 和CISH在細胞中的表達，從而調(diào)控IL-7 介導的JAK-STAT 信號傳導和TCR 介導的ERK/AKT 信號傳導之間的平衡來控制T 細胞穩(wěn)態(tài)。另外，缺乏METTL3 的幼稚T 細胞表現(xiàn)出Th1 和Th17 細胞的減少，Th2 細胞增加，Treg 細胞相對于野生型幼稚T 細胞沒有變化。然而，Tregs 中METTL3 的特異性缺失，會導致Treg 免疫抑制功能喪失和嚴重的自身免疫性疾病[13]?？梢妋6A 可能是輔助性T 細胞分化和維持各類T 細胞功能的重要調(diào)控因子。

巨噬細胞是先天免疫系統(tǒng)的細胞成分，幾乎存在于所有組織中。研究表明，F(xiàn)TO 可促進M1 和M2巨噬細胞的活化。敲低FTO 可抑制NF-κB 信號通路，并降低STAT1 和PPAR-γ 的mRNA 穩(wěn)定性，從而阻止巨噬細胞激活[14]。小鼠巨噬細胞M1 極化后，METTL3 被特異性上調(diào)。經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染的方法敲除METTL3 基因后，M1 巨噬細胞極化受到明顯抑制，但M2 巨噬細胞極化增強。而METTL3 的過表達可大大促進M1 極化，減弱M2 極化。可見，METTL3 通過m6A 甲基化修飾mRNA 來調(diào)控巨噬細胞極化[15]。

作為專職的抗原提呈細胞，樹突狀細胞（dendritic cells，DC） 對連接先天性免疫應答和適應性免疫應答具有重要作用。體內(nèi)實驗顯示，METTL3 介導的m6A 甲基化以m6A 催化活性依賴性方式促進DC 成熟，從而促進T 細胞增殖，且這一過程可能與NF-κB 信號傳導有關(guān)[16]。

3.2 m6A 與抗炎癥免疫

牙髓炎是由口腔細菌感染引起的一種典型的炎癥性疾病。髓樣分化主要反應基因88（myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88） 參與的信號通路在牙髓炎誘導炎癥介質(zhì)過程中被激活。MyD88 剪切可產(chǎn)生MyD88L 和MyD88S 兩種亞型。以往的研究表明，METTL3依賴的m6A 修飾在mRNA 剪接中起著重要作用。Feng 等發(fā)現(xiàn)METTL3 基因敲除促進了MYD88S 的表達，這種剪接變異抑制了炎癥細胞因子的產(chǎn)生，可見METTL3 可能通過調(diào)節(jié)MYD88 的選擇性剪接來抑制脂多糖誘導的人牙髓細胞的炎癥反應[17]。此外，體外實驗表明，METTL3 可以通過NF-κB 信號通路減輕脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥反應[18]。在METTL3 高表達的巨噬樣細胞中巨噬細胞的增殖受到抑制，且明顯降低脂多糖誘導的IL-6 和TNF-α 的產(chǎn)生。作為m6A 的識別蛋白，YTHDF2 也可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞中MAP2K4 和MAP4K4 mRNA 的穩(wěn)定性參與調(diào)控脂多糖刺激的炎癥反應[19]。這些發(fā)現(xiàn)為表觀遺傳在自身免疫性炎癥性疾病發(fā)病機制中的研究提供了新的方向。

3.3 m6A 與抗腫瘤免疫

研究表明，m6A 修飾通過多種機制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。METTL14 通過以m6A 依賴性方式增加腫瘤抑制因子miR126 水平，抑制肝細胞癌轉(zhuǎn)移。在發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝細胞癌組織中，可以觀察到METTL14 水平顯著降低[20]。METTL3 高表達導致腫瘤抑制因子SOCS2 的m6A 修飾增加。YTHDF2 直接識別m6A 修飾后的SOCS2 mRNA，從而誘導SOCS2 降解，促進肝細胞癌的發(fā)展[21]。在肝細胞癌中，YTHDF2 還可以改變腫瘤血管通透性影響腫瘤生長[22]。

缺氧是腫瘤微環(huán)境的常見特征。Zhang 等[23]證明低氧可以以缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）依賴的方式誘導乳腺癌細胞中ALKBH5 表達。ALKBH5 減少了NANOG mRNA 的m6A 修飾進而增強了其穩(wěn)定性。NANOG是一種多能性因子，對于腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是必需的。HIF依賴的ALKBH5 表達降低了缺氧微環(huán)境中m6A 的甲基化水平并促進了乳腺癌干細胞的富集。

惡性膠質(zhì)瘤是最致命的原發(fā)性腦腫瘤，多種m6A 修飾蛋白參與其進展。研究表明[24]，METTL3 或METTL14 表達下調(diào)促進膠質(zhì)瘤干細胞的增殖和自我更新能力，最終導致惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生。相反，抑制FTO 表達可提高m6A 水平并有效抑制膠質(zhì)瘤進程。ALKBH5 通過m6A 修飾增強FOXM1 表達，從而促進膠質(zhì)瘤干細胞增殖和膠質(zhì)瘤進程。

此外，包含m6A 修飾的DC 還參與了腫瘤免疫逃避機制。最新一項研究表明，YTHDF1 通過識別DC 中m6A 修飾的mRNA，增強其翻譯來促進DC 中溶酶體蛋白酶介導的腫瘤新抗原的降解，從而抑制DC 向T 細胞呈遞腫瘤新抗原，促進腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視[25]。這一發(fā)現(xiàn)提示YTHDF1 可以與DC 疫苗聯(lián)合用于免疫治療。

3.4 m6A 與抗病毒免疫

m6A 修飾與宿主的抗病毒機制有關(guān)。RNA 解旋酶DDX46 通過募集ALKBH5 降低MAVS、TRAF3 和TRAF6等編碼參與抗病毒應答的信號分子RNA 上的m6A 修飾水平，阻止它們從細胞核進入細胞質(zhì)，從而降低它們的翻譯水平，減少I 型干擾素的產(chǎn)生而發(fā)揮抗病毒先天免疫應答的作用[26]。YTHDF 蛋白在CD4+T 細胞中的過表達增加了病毒復制以及HIV-1 病毒蛋白和mRNA 的表達。Kennedy 和Lichinchi 等認為，轉(zhuǎn)錄后m6A 修飾和YTHDF1-3 蛋白是HIV-1 感染的正調(diào)節(jié)劑[27，28]。相反，Tirumuru 等發(fā)現(xiàn)YTHDF1-3 是抑制因子并降低了HIV-1反轉(zhuǎn)錄，以抑制過表達后CD4+T細胞中的HIV-1 感染[29]。二者的差異可能是因為YTHDF1-3 在不同細胞系中的不同作用或者檢測方法不同造成的。總之，m6A 甲基化可能通過調(diào)節(jié)T 細胞來間接調(diào)節(jié)宿主的抗病毒作用，這也可能為抗病毒治療提供了新策略。

4 結(jié)語

在編碼器、消碼器和讀碼器的作用下，m6A 幾乎參與了RNA 從轉(zhuǎn)錄到翻譯的全過程，特別是mRNA 剪接、穩(wěn)定和翻譯?？梢妋6A 修飾在免疫調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。雖然我們已經(jīng)了解m6A 與炎癥反應、抗病毒免疫、抗腫瘤免疫等免疫學生理病理相關(guān)，但是其中的具體機制還有待進一步研究。到目前為止，除了在癌癥醫(yī)學領域，只有少數(shù)研究定向于檢查表觀遺傳學及其調(diào)節(jié)劑在免疫學和風濕病的臨床適用性。因此，我們需要對m6A 進行更加深入的研究，以便更好地了解這種修飾對不同免疫性疾病的影響，發(fā)現(xiàn)更多潛在治療的機會。