花旗松素在小鼠心肌肥厚及纖維化中的作用及機制研究

呂瑾 劉長召 華曉芳 楊勝祥

心肌重構(gòu)指各種病理生理刺激引起心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能改變，其特征是心肌細胞體積增大，心室壁厚度增加，心臟成纖維細胞過度活化并產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)，進而導(dǎo)致心臟順應(yīng)性及舒縮功能下降，最終誘發(fā)心力衰竭[1]。靶向抑制心肌肥厚和纖維化，對延緩心肌重構(gòu)進程及治療心力衰竭具有重要意義。

花旗松素(taxifolin，TXL)也稱為二氫槲皮素，是松科植物(如花旗松和紅豆杉)中常見的黃酮類物質(zhì)。TXL具有抗癌、抗氧化、抗炎和抗菌等活性[2]。TXL可通過協(xié)同抑制Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(JAK2/STAT3)信號通路減輕小鼠腦組織淀粉樣變[3]，還可通過調(diào)節(jié)Notch1信號通路和JAK2/STAT3信號通路影響輔助性T細胞(Th細胞)活化，減輕小鼠中咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病[4]。STAT3介導(dǎo)的炎性反應(yīng)是導(dǎo)致心肌重構(gòu)的重要機制[5]。因此，TXL可能夠通過調(diào)節(jié)小鼠心肌中STAT3介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，抑制壓力負荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚及纖維化。本研究通過構(gòu)建主動脈縮窄術(shù)(AB)誘導(dǎo)的小鼠心肌重構(gòu)模型，觀察并探究TXL對小鼠心功能、心肌肥厚及纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TXL(HY-N0136)購自于上海MCE公司，純度≥98%；抗CD45、CD68、p-STAT3、t-STAT3及GAPDH抗體均購自于美國Abcam公司；免疫組織化學(xué)DAB試劑盒(GK600710)購于美國Gene-tech公司；羊抗兔IgG二抗購于美國LICOR公司。

1.2 實驗動物及模型建立

6～8周雄性C57/B6小鼠體質(zhì)量230～300 g，購于湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心。根據(jù)隨機數(shù)表法將30 只小鼠隨機分為假手術(shù)組、AB組及AB+TXL組，每組10只。AB組和AB+TXL組手術(shù)操作步驟如下：(1)經(jīng)腹腔注射給予小鼠 3%異戊巴比妥麻醉，同時經(jīng)口氣管插管輔助呼吸。(2)沿小鼠胸部2～3肋間隙水平方向切開皮膚并分離降主動脈，將26號針置于主動脈旁并結(jié)扎。(3)結(jié)扎后迅速拔出針頭，逐層縫合小鼠肌肉及皮膚。術(shù)后8周可成功建立壓力負荷誘導(dǎo)的心肌肥厚及纖維化模型。AB+TXL組小鼠于AB術(shù)后第2天開始，每日上午9點給予20 mg/kg TXL灌胃，持續(xù)8周。

1.3 多普勒超聲檢測

各組小鼠通過吸入1.5%異氟烷麻醉，剔去其心前區(qū)毛發(fā)，放置于37 ℃的恒溫加熱板。采用MyLab 30CV多普勒超聲診斷儀檢測各組小鼠心功能。在靠近小鼠乳頭肌水平的胸骨旁長軸和胸骨旁短軸上以2D模式成像，記錄2D引導(dǎo)下穿過左心室前壁和后壁的M型超聲，收集心率(HR)、左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)及左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)等參數(shù)，各參數(shù)取4個連續(xù)心動周期的平均值。超聲檢測后，通過頸椎脫臼法處死各組小鼠，測量體質(zhì)量，獲取小鼠心臟，用吸水紙擦干心臟殘余液體，測量心臟質(zhì)量，計算心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值(HW/BW)。

1.4 實時聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測

取小鼠左室心肌20～30 mg，剪碎并研磨后提取總RNA。利用紫外分光光度計檢測所獲RNA 的濃度及純度，通過AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。對cDNA進行qRT-PCR擴增，反應(yīng)體系為：1 μL cDNA，10 μL SyBr Green，8 μL DEPC水，0.5 μL正向引物及反向引物(見表1)。以β-actin作為內(nèi)參基因進行校正。

表1 實時聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.5 Western blot檢測

將各組心肌組織在裂解緩沖液中充分研磨后進行超聲裂解，將裂解液離心后吸取上清，采用BCA法測量總蛋白濃度。取各組小鼠心肌組織總蛋白進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜，加入抗p-STAT3、t-STAT3及GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗，避光孵育1 h，利用Odyssey掃膜儀對蛋白條帶進行掃描并定量，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白進行校正。

1.6 HE染色及PSR染色

將各組心肌組織放置于10%福爾馬林中過夜，脫水后石蠟包埋、切片。對切片進行HE染色：將切片分別置于二甲苯、濃度梯度的乙醇及蘇木素中浸泡，樹脂封片，光鏡下觀察并拍照。對切片進行PSR染色：切片經(jīng)二甲苯及濃度梯度的乙醇脫水后，在天狼星紅飽和苦味酸液中浸泡20 min，無水乙醇分化與脫水后封片，光鏡下觀察并拍照。Image-ProPlus 6.0軟件評估各組心肌細胞橫截面積及心肌組織中膠原百分比。

1.7 免疫組化檢測

各組心肌石蠟切片于二甲苯及濃度梯度乙醇中分化脫水，3%雙氧水甲醇抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，羊血清封閉1 h，分別加入抗CD45抗體(1∶200)和抗CD68抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜。加入二抗后，用二氨基聯(lián)苯胺進行顯色。每組隨機選擇 6個樣本，每個樣本隨機選取5個視野，在光鏡下觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差來表示，兩組間比較采用t檢驗，3組及以上組間比較用One-way ANOVA分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心功能檢測

3組小鼠心室率無統(tǒng)計學(xué)差異，表明各組心功能具有可比性。與假手術(shù)組小鼠相比，AB組小鼠LVEF及LVFS明顯降低，LVEED及LVESD明顯升高(P均<0.05)；與AB組小鼠相比，AB+TXL組小鼠LVEF及LVFS明顯升高，LVEED及LVESD亦明顯降低(P均<0.05)，見表2。

2.2 各組小鼠心肌肥厚指標檢測

與假手術(shù)組相比，AB組小鼠心臟大體橫截面積及心肌細胞橫截面積明顯增大，心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比值明顯升高，心肌肥厚標志基因ANP mRNA表達水平明顯上調(diào)(P均<0.05)；TXL干預(yù)后，AB+TXL組小鼠心臟大體橫截面積及心肌細胞橫截面積明顯減小，心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比值及ANP mRNA表達水平也明顯降低(P均<0.05)。見圖1、表3。

表2 3組小鼠心功能比較

圖 1 3組小鼠心臟HE染色結(jié)果

表3 3組小鼠心肌肥厚指標比較

2.3 各組小鼠心肌纖維化指標檢測

與假手術(shù)組相比，AB組心肌間質(zhì)及血管周膠原沉積明顯增加，心肌纖維化標志基因Ctgf mRNA表達水平明顯上調(diào)(P均<0.05)；與AB組相比，AB+TXL組小鼠心肌間質(zhì)及血管周膠原沉積明顯降低，Ctgf mRNA表達水平明顯下降(P均<0.05)。見圖2、表4。

圖 2 3組小鼠心肌間質(zhì)及血管周PSR染色結(jié)果

表4 3組小鼠心肌纖維化指標比較

2.4 各組小鼠心肌組織炎性反應(yīng)及相關(guān)基因表達情況

與假手術(shù)組相比，AB組小鼠心肌組織中CD45及CD68的蛋白表達水平明顯升高(P均<0.05)，表明AB組小鼠心肌組織中白細胞及巨噬細胞浸潤數(shù)量明顯增多，同時促炎性細胞因子IL-6的mRNA表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)，表明AB組小鼠心肌組織炎性反應(yīng)被激活。與AB組相比，AB+TXL組小鼠心肌組織白細胞及巨噬細胞浸潤數(shù)量、IL-6的mRNA表達水平均明顯被抑制(P均<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，TXL能夠明顯抑制AB誘導(dǎo)的小鼠心肌組織STAT3蛋白磷酸化水平(P均<0.05)。見圖3、圖4、表5。

圖 3 3組小鼠心肌組織炎性細胞浸潤情況

圖 4 3組小鼠心肌組織STAT3通路相關(guān)蛋白表達情況

3 討論

心力衰竭與不良心室重構(gòu)密切相關(guān)[6]。炎性反應(yīng)是急性心肌梗死后不良重構(gòu)的驅(qū)動因素。缺血應(yīng)激誘發(fā)心臟炎性反應(yīng)，死亡的心肌細胞釋放的損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)可上調(diào)炎性細胞因子和趨化因子的表達，引起心肌組織免疫細胞募集和炎性級聯(lián)反應(yīng)[7]。研究表明，心臟炎性反應(yīng)也可以在非缺血條件下激活。研究表明，胸主動脈縮窄術(shù)(TAC)后6周小鼠心肌組織即出現(xiàn)了明顯的炎性基因激活及炎性細胞浸潤。TAC后數(shù)天至數(shù)周，心臟中巨噬細胞和T細胞浸潤顯著增加，且與心肌纖維化和不利的心室重構(gòu)有關(guān)[8]。因此，以心肌組織炎性反應(yīng)為靶點預(yù)防和治療非缺血因素誘導(dǎo)的心肌肥厚及纖維化具有重要的臨床意義。

表5 3組小鼠心肌炎性反應(yīng)指標及p-STAT3/t-STAT3蛋白表達水平比較

STAT3作為哺乳動物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，對維持細胞代謝穩(wěn)態(tài)具有重要意義[9]。研究表明，過表達STAT3能夠誘導(dǎo)小鼠心臟發(fā)生自發(fā)性心肌肥厚。機制上，STAT3可通過轉(zhuǎn)錄激活I(lǐng)L-6的表達促進心肌細胞肥大[10]。在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和高鹽誘導(dǎo)的高血壓模型中，IL-6缺失可抑制心臟炎性反應(yīng)、心肌纖維化和心功能障礙，但并不影響心肌肥厚[11]。另一方面，心臟特異性過表達STAT3能夠抑制化療藥物阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷和心功能不全[10]。在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚及心肌纖維化模型中，STAT3可直接被活化的β腎上腺素受體激活。敲除心肌細胞STAT3可顯著降低心肌收縮功能，引起心肌肥厚及纖維化[12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AB術(shù)后8周小鼠心肌組織中STAT3磷酸化水平明顯升高。同時，IL-6 mRNA的表達水平明顯升高，表明在壓力負荷誘導(dǎo)的慢性心肌肥厚及纖維化中，STAT3/IL-6介導(dǎo)的炎性信號通路被激活。

TXL是一種天然化合物單體，可在炎癥、腫瘤、微生物感染、氧化應(yīng)激、心血管和肝臟疾病中發(fā)揮藥理作用。TXL可通過改善線粒體功能及糖代謝減輕鄰苯二甲酸二酯誘導(dǎo)的雞心肌細胞肥大[13]。此外，TXL可通過抑制線粒體凋亡通路減輕大鼠缺血再灌注損傷[14]。Sun等[15]揭示TXL可通過抑制心肌細胞氧化應(yīng)激和凋亡改善糖尿病心肌病。本研究發(fā)現(xiàn)，在壓力負荷誘導(dǎo)的心肌肥厚及纖維化中，TXL可明顯提高小鼠心臟LVEF及LVFS率，改善心功能。TXL不僅抑制心肌細胞肥大及肥厚基因ANP的表達，還可抑制心肌間質(zhì)及血管周圍膠原沉積及促纖維化基因Ctgf的表達；TXL可能通過抑制STAT3/IL-6介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，減少心肌組織中白細胞和巨噬細胞浸潤。因此，TXL可通過抑制心肌組織中STAT3依賴的炎性信號的激活，改善壓力負荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)，但具體分子靶點仍需進一步研究。