糖尿病自身抗體微陣列芯片檢測(cè)試劑盒的研制與初步評(píng)價(jià)*

胡紀(jì)文，陳卓誠(chéng)，張大準(zhǔn)，段江磊，高 龍，林 珊，黃日雄，張秀明△

(1.廣東省深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東深圳 518001；2.廣東省深圳市伯勞特生物制品有限公司，廣東深圳 518054)

1型糖尿病(T1DM)包括免疫介導(dǎo)和特發(fā)性兩種亞型[1]。自身免疫性糖尿病(免疫介導(dǎo)型)是以胰島β細(xì)胞自身免疫破壞為重要病因的一種疾病，患者體內(nèi)存在一種或多種針對(duì)胰島β細(xì)胞胰島素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌的關(guān)鍵酶的自身抗體，這些自身抗體在糖尿病的預(yù)測(cè)、診斷、分型及治療方面具有重要意義[2-3]。本研究參照文獻(xiàn)[4]建立微陣列芯片(Array-ELISA)，用于聯(lián)合檢測(cè)T1DM組谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)、酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A)、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8抗體(ZnT8A)、胰島細(xì)胞抗體(ICA)、胰島素抗體(IAA)5種抗體。研究報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本

1.1.1參考品血清標(biāo)本來(lái)源與制備 本研究參考品原材料為不同陽(yáng)性程度的血清標(biāo)本和體檢者血清標(biāo)本，經(jīng)乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗體、艾滋病病毒抗體檢測(cè)均為陰性，用斯德潤(rùn)(北京)醫(yī)療診斷用品有限公司生產(chǎn)的糖尿病自身抗體譜檢測(cè)試劑盒[免疫印跡法(IBT)]檢測(cè)，陽(yáng)性參考品和精密度參考品按照檢測(cè)結(jié)果選擇合適的陽(yáng)性血清標(biāo)本混合，必要時(shí)可用陰性血清標(biāo)本稀釋。陰性參考品用陰性血清標(biāo)本混合。

10份陽(yáng)性參考品抗體型別包含GADA、IA-2A、ICA、ZnT8A、IAA，10份陰性參考品GADA、IA-2A、ICA、ZnT8A、IAA抗體全部為陰性。2份精密度參考品為R1(GADA/IA-2A/ICA/ZnT8A/IAA)、R2(GADA/IA-2A/ICA/ZnT8A/IAA)。檢測(cè)限參考品1系列用于對(duì)GADA、IA-2A、ZnT8A的最低檢測(cè)限評(píng)價(jià)，2系列用于對(duì)ICA和IAA的最低檢測(cè)限評(píng)價(jià)。檢測(cè)限參考品L3為混合陽(yáng)性血清標(biāo)本，必要時(shí)可用陰性血清標(biāo)本稀釋，其相應(yīng)抗體陽(yáng)性指數(shù)(PI)范圍為1.8～2.4；L3用陰性血清標(biāo)本稀釋1倍后得到對(duì)應(yīng)的L2，其相應(yīng)抗體PI范圍為0.9～1.2；L2用陰性血清標(biāo)本稀釋1倍后得到對(duì)應(yīng)的L1，其相應(yīng)抗體PI范圍為0.4～0.6。

1.1.2臨床比對(duì)血清來(lái)源 選取2018年1月至2019年12月在深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院和羅湖區(qū)中醫(yī)院門(mén)診就診的T1DM患者的42份血清作為T(mén)1DM組，另選取同期在羅湖區(qū)中醫(yī)院門(mén)診就診的2型糖尿病(T2DM)患者的30份血清、體檢健康者的54份血清分別作為T(mén)2DM組、對(duì)照組。

1.2儀器和試劑

1.2.2試劑及試劑盒 96孔板(Biomat公司)；GAD65抗原/IA-2抗原(菲鵬生物)；ICA抗原/ZnT8抗原(北京華信行公司)；insulin抗原(Lee Biosolutions,Inc.)；人IgG(Equitech-Bio,Inc.)；兔抗人IgG(Jackson ImmunoResearch Inc.)；抗人IgG-HRP(百美瑞生物)；HRP結(jié)合物穩(wěn)定劑(Surmodics,Inc.)；The Blocking Solution/Liquid Plate Seal(Candor Bioscience)；TMB沉淀型底物(英創(chuàng)生物)；其它化學(xué)試劑均為AR級(jí)。斯德潤(rùn)(北京)醫(yī)療診斷用品有限公司生產(chǎn)的糖尿病自身抗體譜檢測(cè)試劑盒(IBT)，批號(hào)：010306D/0A。

1.3方法

1.3.1Array-ELISA設(shè)計(jì) 按照?qǐng)D1模式圖的布局進(jìn)行Array-ELISA設(shè)計(jì)，PR點(diǎn)為位置參考點(diǎn)，PC點(diǎn)為陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)，NC點(diǎn)為陰性對(duì)照點(diǎn)，CO點(diǎn)為臨界值對(duì)照點(diǎn)，SC點(diǎn)為標(biāo)本對(duì)照點(diǎn)，GAD、IA2、ICA、ZnT8、INS分別為抗原點(diǎn)。

圖1 糖尿病自身抗原Array-ELISA模式和實(shí)物圖

1.3.296孔Array-ELISA制備 上述各芯片點(diǎn)點(diǎn)樣液配制，用PBS(0.01 mol/L PBS，含15%甘油、10%海藻糖，pH值7.2)配制40 μg/mL的GAD抗原、60 μg/mL的IA-2抗原、10 μg/mL的ICA抗原，用Tris(0.02 mol/L Tris，含15%甘油、10%海藻糖，pH值8.5)配制20 μg/mL的ZnT8抗原，用CB(0.05 mol/L CB，含15%甘油、10%海藻糖，pH值9.6)配制80 μg/mL 的INS抗原、2 μg/mL的RAH作SC點(diǎn)、2 μg/mL的IgG作PR及PC點(diǎn)、0.12 μg/mL的IgG作CO點(diǎn)、0.05 μg/mL的IgG作NC點(diǎn)。使用BioDot AD6020芯片點(diǎn)樣儀按照?qǐng)D1模式以每點(diǎn)20 nL在96孔板底部點(diǎn)樣，點(diǎn)樣結(jié)束后放入冰箱(2～8 ℃)固定16 h。次日洗板2次，加入2%的酪蛋白室溫封閉1 h，吸干封閉液，在37 ℃烘箱中干燥2 h。密封后置于4 ℃保存待用。

1.3.3檢測(cè)試驗(yàn) 96孔Array-ELISA平衡至室溫后，用Tris樣品稀釋液稀釋血清26倍，取稀釋液100 μL加入反應(yīng)孔中，室溫反應(yīng)60 min；洗滌3次；將0.3 mg/mL的抗人IgG抗體稀釋2 000倍，每孔加入50 μL，室溫反應(yīng)30 min；洗滌液3次；每孔加入TMB芯片底物50 μL，室溫反應(yīng)30 min，吸取底物后，將96孔芯片放入生物芯片閱讀儀，用DM-5Abs程序進(jìn)行掃描判讀，軟件統(tǒng)計(jì)各抗體的PI，PI≥1.0為陽(yáng)性,PI<1.0為陰性。

1.3.4性能評(píng)價(jià)

1.3.4.1符合率 檢測(cè)10份陽(yáng)性參考品和10份陰性參考品PI值結(jié)果，計(jì)算符合率。

1.3.4.2重復(fù)性 分別檢測(cè)R1、R2批內(nèi)10次PI值結(jié)果，計(jì)算變異系數(shù)(CV)值。

本項(xiàng)目系統(tǒng)地研究了一系列可適用于野外現(xiàn)場(chǎng)分析的快速、簡(jiǎn)單、高效的樣品分離富集前處理技術(shù)與便攜式鎢絲電熱原子吸收光譜儀聯(lián)用，在一定程度上提高該儀器的分析性能，對(duì)于推動(dòng)該儀器走向現(xiàn)場(chǎng)快速分析起到了較為積極的作用，同時(shí)通過(guò)這些研究工作也進(jìn)一步加強(qiáng)了新型分離富集技術(shù)及其與鎢絲電熱原子吸收光譜法、火焰原子吸收光譜法乃至分光光度法聯(lián)用方面的理論和應(yīng)用研究。

1.3.4.3最低檢出限 L1相應(yīng)抗體檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性，L2相應(yīng)抗體檢測(cè)結(jié)果可為陰性或者陽(yáng)性，L3相應(yīng)抗體檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。

1.3.5臨床應(yīng)用評(píng)價(jià) 以Array-ELISA為試驗(yàn)方法，糖尿病自身抗體譜檢測(cè)試劑盒(IBT)為比對(duì)方法，同步檢測(cè)3組血清標(biāo)本，計(jì)算各抗體陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率，Kappa值。以總符合率大于90.00%為符合率可接受的標(biāo)準(zhǔn)，Kappa值>0.75，P>0.05時(shí)為一致性較好。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)靈敏度、特異度，評(píng)價(jià)方法的臨床適用性。

1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。一致性分析采用Kappa一致性檢驗(yàn)，0.0≤Kappa≤0.2為微弱一致性，0.2

2 結(jié) 果

2.1陽(yáng)性參考品符合率 試驗(yàn)結(jié)果顯示10份陽(yáng)性參考品檢測(cè)均為陽(yáng)性，符合率為100.00%。

2.2陰性參考品符合率 試驗(yàn)結(jié)果顯示10份陰性參考品檢測(cè)均為陰性，符合率為100.00%。

2.3重復(fù)性檢測(cè) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，樣品各抗原的批內(nèi)重復(fù)性CV均小于15.00%。

2.4最低檢測(cè)限檢測(cè) 分別用檢測(cè)限參考品1系列、2系列進(jìn)行5種糖尿病自身抗體檢測(cè)，各抗體PI結(jié)果顯示，L1均為陰性，L2、L3均為陽(yáng)性。見(jiàn)表1。

2.5方法學(xué)比較 采用Array-ELISA與IBT法同步檢測(cè)T1DM組、T2DM組和對(duì)照組血清標(biāo)本，GADA陽(yáng)性符合率95.45%,陰性符合率94.23%，總符合率94.44%；IA-2A陽(yáng)性符合率73.33%，陰性符合率100.00%，總符合率96.83%；ICA陽(yáng)性符合率93.75%，陰性符合率98.18%，總符合率97.62%；ZnT8A陽(yáng)性符合率100.00%，陰性符合率99.08%，總符合率99.21%；IAA陽(yáng)性符合率90.91%，陰性符合率97.39%，總符合率96.83%。5種抗體的總符合率均大于90.00%。5種抗體Kappa值統(tǒng)計(jì)均大于0.75，P值均大于0.05，兩種檢測(cè)方法具有高度的一致性。見(jiàn)表2、3。

表1 最低檢測(cè)限檢測(cè)結(jié)果(PI)

表2 Array-ELISA與IBT法檢測(cè)血清5種抗體結(jié)果(n)

表3 Array-ELISA與IBT法檢測(cè)血清5種抗體結(jié)果一致性比較(%)

2.6臨床應(yīng)用評(píng)價(jià) 使用本研究所建立的糖尿病自身抗體Array-ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)3組血清5種抗體進(jìn)行檢測(cè)，T1DM組5種抗體的陽(yáng)性率高于T2DM組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。Array-ELISA檢測(cè)T1DM 5種抗體的靈敏度除GADA為59.52%較高外，其余4種自身抗體指標(biāo)的靈敏度均低于50.00%。但5種抗體聯(lián)合檢測(cè)T1DM的靈敏度達(dá)88.10%，特異度為90.70%，見(jiàn)表5。

表4 Array-ELISA檢測(cè)3組血清5種抗體的結(jié)果[ n(%)]

表5 Array-ELISA檢測(cè)T1DM 5種自身抗體的效果評(píng)價(jià)(%)

3 討 論

在T1DM發(fā)病前、發(fā)病早期和發(fā)病后會(huì)產(chǎn)生許多自身抗體，直到目前為止，與T1DM相關(guān)的自身抗體仍不斷被發(fā)現(xiàn)。通過(guò)大量的研究，人們已經(jīng)清楚地認(rèn)識(shí)到，要確切地診斷T1DM，僅一種自身抗體指標(biāo)的預(yù)測(cè)能力是非常有限的。研究表明，聯(lián)合多種抗體測(cè)定可提高胰島自身抗體的檢出率[5]。謝志國(guó)等[6]報(bào)道，在新診斷的T1DM患者中，單獨(dú)檢測(cè)GADA陽(yáng)性率為70.2%(144/205)；聯(lián)合檢測(cè)GADA+IA-2A，任一抗體陽(yáng)性者166例，陽(yáng)性率提高至81.0%(與GADA單獨(dú)檢測(cè)相比，P<0.05)；在檢測(cè)GADA和IA-2A的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步聯(lián)合檢測(cè)ZnT8A，任一抗體陽(yáng)性者為170例，陽(yáng)性率進(jìn)一步提高至82.9%，但與 GADA+IA-2A聯(lián)合檢測(cè)相比，陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研制并應(yīng)用可實(shí)現(xiàn)多種胰島自身抗體聯(lián)合檢測(cè)的方法有重要的臨床意義，可減少T1DM尤其是臨床特征不典型的T1DM患者的漏診[7]。本研究研制的糖尿病自身抗體檢測(cè)試劑盒Array-ELISA可同時(shí)檢測(cè)ICA、IAA、GADA、IA-2A和ZnT8A 5種抗體，對(duì)42例臨床確診T1DM患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，5種抗體聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為88.10%，特異度為90.70%，陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果可以有效鑒別診斷T1DM，指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)治療。

糖尿病自身抗體的測(cè)定方法主要包括免疫組化法、放射免疫分析法(RIA)、ELISA、IBT、化學(xué)發(fā)光法(CLIA)、放射配體分析法(RBA)等。其中免疫組化法具有準(zhǔn)確度高、特異度強(qiáng)、重復(fù)性好且直觀的特點(diǎn)，但由于操作繁瑣耗時(shí)已逐漸被ELISA替代。RIA是一種十分經(jīng)典的方法，較早應(yīng)用于胰島自身抗體的測(cè)定，具有較高的靈敏度和特異度，但是由于存在放射性污染，目前臨床已經(jīng)很少使用。ELISA是應(yīng)用較成熟的一種方法，可得到較可靠的結(jié)果，但利用該法進(jìn)行多指標(biāo)聯(lián)合測(cè)定則存在檢測(cè)費(fèi)時(shí)、報(bào)告周期較長(zhǎng)等不足。IBT結(jié)合了聚丙烯酰凝膠電泳的高分辨率和免疫標(biāo)記技術(shù)的高特異度及靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)開(kāi)始應(yīng)用于胰島自身抗體的測(cè)定，該方法簡(jiǎn)便，可一次同時(shí)測(cè)定幾種自身抗體，其特異度好，但靈敏度也有待提高[8-9]。CLIA是近年發(fā)展起來(lái)的檢驗(yàn)方法之一，具有高通量、高特異度及靈敏度、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，但一次只能檢測(cè)一個(gè)抗體。多年來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)化工作證實(shí)，RBA因其靈敏度和特異度高，結(jié)果重現(xiàn)性好，檢測(cè)線性范圍寬，被歐美發(fā)達(dá)國(guó)家認(rèn)定為胰島自身抗體檢測(cè)的參考方法(金標(biāo)準(zhǔn))[10]，但該方法操作復(fù)雜，檢測(cè)步驟多，影響因素多，并不適合臨床檢測(cè)。因此，發(fā)展準(zhǔn)確快速、靈敏特異、并可以同時(shí)測(cè)定多指標(biāo)的新技術(shù)和新方法非常必需。本研究研制的糖尿病自身抗體檢測(cè)試劑盒Array-ELISA與IBT相比，兩種方法均可以檢測(cè)5種自身抗體，同時(shí)對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，5種自身抗體的總符合率均在90.00%以上，Kappa值均大于0.75，兩種方法具有高度一致性。

目前有部分檢測(cè)試劑可以在診斷DM基礎(chǔ)上初步分型，如英國(guó)RSR(GADA、IA-2A、ZnT8A)免疫放射IRMA試劑盒、德國(guó)MedipanGmbh(GADA、IA-2A)ELISA檢測(cè)試劑盒、美國(guó)Biomerica(GADA、IAA、ICA)ELISA檢測(cè)試劑盒，國(guó)內(nèi)深圳市伯勞特公司糖尿病分型試劑盒(IBT法)、深圳賽爾(GADA、IAA、ICA)ELISA檢測(cè)試劑盒、斯德潤(rùn)(北京)醫(yī)療診斷用品有限公司生產(chǎn)的糖尿病自身抗體譜檢測(cè)試劑盒。相比于現(xiàn)有試劑盒，本研究制備的試劑盒采用Array-ELISA技術(shù)，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)96孔板作為固相，兼容各種酶標(biāo)洗板機(jī)及自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)，解決了手工操作印跡膜條的操作復(fù)雜、重復(fù)性差、均一性差等問(wèn)題，同時(shí)又具有高通量的特點(diǎn)。檢測(cè)結(jié)果由生物芯片閱讀儀自動(dòng)判讀，檢測(cè)結(jié)果客觀，避免人工肉眼判斷的主觀性，更加適用于臨床上對(duì)糖尿病自身抗體的檢測(cè)，有效輔助糖尿病的分型診斷，從而實(shí)現(xiàn)T1DM患者的早期正確診斷。