雷諾嗪預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2 心肌細(xì)胞自噬的調(diào)控及對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

趙 茜, 劉明遠(yuǎn), 李 萌, 欒海艷, 楊 玉, 馬春艷, 張寶成, 趙錦程, 楊光遠(yuǎn)

（1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154002）

針對心肌梗死進(jìn)行再灌注治療可明顯改善患者的生存率，但再灌注過程中卻出現(xiàn)了心肌繼發(fā)性損傷或細(xì)胞死亡的病理現(xiàn)象即心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI），導(dǎo)致心臟組織損傷或功能障礙，并增加心肌梗死范圍［1-2］。自噬是細(xì)胞中去除受損物質(zhì)和更新細(xì)胞器的一種降解過程［3-4］，適度自噬可以保護(hù)細(xì)胞免受各種損害，但是，過度自噬會導(dǎo)致重要的細(xì)胞器降解，從而損害細(xì)胞。心肌細(xì)胞自噬與MIRI 和心力衰竭等多種心血管疾病的發(fā)病機制有密切關(guān)聯(lián)［5］，可明顯影響MIRI 程度，表明對自噬的治療性干預(yù)可能有益于MIRI 心肌的預(yù)后。雷諾嗪是心肌細(xì)胞晚期鈉電流的選擇性抑制劑，可防止細(xì)胞中鈣離子蓄積，減少缺血心肌耗能，從而對MIRI 心肌起保護(hù)作用，但其作用機制尚未完全闡明。本課題組前期研究［6］顯示：雷諾嗪預(yù)處理對大鼠MIRI 心肌起保護(hù)作用，且呈劑量依賴性。本研究在此基礎(chǔ)上，建立體外缺氧/復(fù)氧損傷模型，研究雷諾嗪預(yù)處理保護(hù)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞是否是通過哺乳動物雷帕素靶蛋白（mamalian target of rapamycin，mTOR） 調(diào)控自噬水平實現(xiàn)的， 為雷諾嗪治療MIRI 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器心肌H9C2 細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM 培養(yǎng)基購于美國Hyclone 公 司， 胎 牛 血 清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 購于美國BI 公司，雷諾嗪購于大連美侖生物技術(shù)有限公司，渥曼青霉素和雷帕霉素購于北京索萊寶公司， 微管相關(guān)蛋白輕鏈3 （microtubuleassociated protein light chain 3， LC3） 購 于 美 國Abcam 公 司， mTOR 和 磷 酸 化 mTOR（phosphorylated mTOR， p-mTOR） 購于美國Cell Signaling Technology 公司。 CO2培養(yǎng)箱購于美國SHEL LAB 公司，酶標(biāo)儀購于美國博騰公司，激光共聚焦顯微鏡購于美國Olympus 公司，電泳儀購于美國伯樂公司。

1.2細(xì)胞分組和CCK-8法檢測各組H9C2細(xì)胞活性將H9C2 細(xì) 胞 以1×105mL－1的 密 度 接 種 于96 孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至約80% 時進(jìn)行后續(xù)實驗，將H9C2 細(xì)胞隨機分為正常對照組和不同濃度雷諾嗪組（給予2、5 、10、15 、20和30 μmol·L－1雷諾嗪），每組6 復(fù)孔。藥物孵育24 h 后，每孔加入200 μL 含10% CCK-8 溶 液 的 高 糖DMEM， 置 于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1.5 h。于酶標(biāo)儀上讀取450 nm 處的吸光度（A） 值。將H9C2 細(xì)胞接種于96 孔板，隨機分為正常對照組和不同濃度雷諾嗪組（給予0、2、5、10、 15、20 和30 μmol·L－1雷諾嗪）， 每組6 復(fù)孔。 正常對照組為正常培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞， 不做任何處理， 不同濃度雷諾嗪組H9C2 細(xì)胞給予不同濃度雷諾嗪預(yù)處理30 min 后，每孔更換200 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS），置于37℃、95% N2和5% CO2培養(yǎng)箱中模擬缺氧4 h 后，更換為10%FBS 培養(yǎng)基200 μL 后于5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)模擬復(fù)氧培養(yǎng)3 h。0 μmol·L－1雷諾嗪組即為缺氧/復(fù)氧模型組。CCK-8 法檢測各組細(xì)胞活性，于酶標(biāo)儀上記錄450 nm 處吸光度（A） 值， 以A （450） 值代表細(xì)胞活性。

1.3雷諾嗪對缺氧/復(fù)氧損傷的H9C2細(xì)胞保護(hù)作用實驗分組和處理方式實驗分組為正常對照組、缺氧/復(fù)氧模型組、雷諾嗪預(yù)處理組、雷諾嗪+渥曼青霉素組、雷帕霉素組。正常對照組為常規(guī)培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞。缺氧/復(fù)氧模型組：取生長至80%的H9C2 細(xì) 胞， 更 換 為PBS 緩 沖 液， 于37 ℃、95% N2、5% CO2的培養(yǎng)箱中缺氧處理4 h 后，更換為10% FBS 培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧處理3 h；雷諾嗪預(yù)處理組：20 μmol·L－1雷諾嗪濃度預(yù)處理30 min 后，再行缺氧/復(fù)氧處理；雷諾 嗪+ 渥 曼 青 霉 素 組： 20 μ mol·L－1雷 諾 嗪 和200 nmo·L－1渥曼青霉素預(yù)處理30 min，再行缺氧/復(fù)氧處理；雷帕霉素組：25 g·L－1雷帕霉素預(yù)處理30 min，再行缺氧/復(fù)氧處理。

1.4 CCK-8法檢測缺氧/復(fù)氧損傷后各組細(xì)胞活性操作方法同試劑盒說明書， 酶標(biāo)儀檢測各孔A （450） 值， 以A （450） 值 代 表 各 組 細(xì) 胞活性。

1.5乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒檢測各組H9C2細(xì)胞中LDH水平操作方法同LDH 試劑盒說明書， 酶標(biāo)儀檢測各孔于450 nm 波 長 處A 值， 計 算LDH 活 性。 LDH 活 性（U·L－1）（測定孔A 值－對照孔A 值） /（標(biāo)準(zhǔn)孔A 值－空白孔A 值） ×0.2 mmol·L－1×1 000。

1.6免疫熒光染色技術(shù)檢測各組H9C2細(xì)胞中LC3陽性細(xì)胞率以8×103mL－1的細(xì)胞密度給予6 孔板內(nèi)爬片處理后， 鏡下觀察細(xì)胞融合至約80%，藥物預(yù)處理、缺氧/復(fù)氧處理后，給予細(xì)胞固定、通透、封閉、一抗孵育、FITC 標(biāo)記熒光二抗孵育、DAPI 染核后，于激光共聚焦顯微鏡上觀察。參照既往研究［7］計算LC3 陽性細(xì)胞率（隨機選擇5 個高倍鏡下視野， 每組細(xì)胞總數(shù)不少于100 個）。LC3 陽性細(xì)胞率=LC3 陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 Western blotting 法檢測各組H9C2 細(xì)胞中LC3、mTOR 和p-mTOR 蛋白表達(dá)水平

裂解細(xì)胞，刮取蛋白，以15 000 r·min－1離心蛋白，取上清，調(diào)整蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、5% 脫脂奶粉-TBST 于37 ℃溫箱封 閉2 h、 一 抗（β -actin 、 LC3、 mTOR 和p-mTOR） 4 ℃冰箱過夜孵育、TBST 洗膜，加入對應(yīng)的過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG （H+L）、山羊抗兔IgG （H+L） 二抗于37 ℃溫箱孵育45 min，TBST 洗膜，ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯色，以β-actin 作為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析各蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0 和GraphPad Prism6.01 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細(xì)胞活性、各組H9C2 細(xì)胞中LDH 活性、LC3 陽性細(xì)胞率、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和p-mTOR/mTOR 比 值 以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析LSD 和Tamhane 法。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組H9C2細(xì)胞活性與正常對照組比較，不同濃度雷諾嗪組H9C2 細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）， 即雷諾嗪濃度在2 ～30 μmol·L－1對H9C2 心肌細(xì)胞無毒性作用。 與正常對照組比較，缺氧/復(fù)氧模型組H9C2 細(xì)胞活性下降約41%（P＜0.01）； 與缺氧/復(fù)氧模型組比較， 10、 15、20 和30 μmol·L－1雷 諾 嗪 組 細(xì) 胞 活 性 升 高（P＜0.05），以20 μmol·L－1雷諾嗪組H9C2 細(xì)胞活性升高最為明顯。綜合上述實驗結(jié)果，選定20 μmol·L－1雷諾嗪為最佳藥物濃度以進(jìn)行后續(xù)實驗。見表1。

2.2缺氧／復(fù)氧損傷后各組H9C2細(xì)胞活性和細(xì)胞中LDH活性與正常對照組比較，缺氧/復(fù)氧模型組H9C2 細(xì)胞活性降低（t=18.654，P＜0.01），LDH 活性升高（t=－11.865， P＜0.01）； 與缺氧/復(fù)氧模型組比較，雷諾嗪預(yù)處理組和雷帕霉素組H9C2 細(xì)胞活性明顯升高（P＜0.01）， LDH 活性明顯降低（P＜0.01），雷諾嗪+渥曼青霉素組H9C2 細(xì)胞活性和LDH 活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3各組H9C2細(xì)胞中LC3陽性表達(dá)率鏡下可見，正常對照組H9C2 細(xì)胞中LC3 彌散分布于細(xì)胞漿中，LC3 陽性表達(dá)率為（0.08±0.03） %；與正常對照組比較， 缺氧/復(fù)氧模型組H9C2 細(xì)胞中LC3 表達(dá)水平明顯增多，細(xì)胞中LC3 呈點狀聚集現(xiàn)象， 陽 性 細(xì) 胞 率（0.27±0.07） % 升 高（P＜0.05）；與缺氧/復(fù)氧模型組比較，雷諾嗪預(yù)處理組［（0.55±0.06）%］、 雷帕霉素組［（0.61±0.11）%］ H9C2 細(xì)胞中LC3 陽性表達(dá)率均升高（P＜0.01）；雷諾嗪+渥曼青霉素組LC3 免疫熒光強度明顯降低， 陽性表達(dá)率僅為（0.25±0.04） %，與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1 （插頁八）。

表1 CCK-8 法檢測各組H9C2 細(xì)胞活性Tab.1 Cell viabilities of H9C2 cells in various groups detected by CCK-8 method (n=6，x±s）

表2 缺氧/復(fù)氧損傷后各組H9C2 細(xì)胞活性和細(xì)胞中LDH活性Tab.2 Cell viabilities and LDH activities of H9C2 cells in various groups after hypoxia/reoxygenation injury (n=6，x±s）

2.4各組H9C2細(xì) 胞 中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和p-mTOR/mTOR比值與正常對照組比較，缺氧/復(fù)氧模型組H9C2 細(xì)胞中LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高（P＜0.01）， p-mTOR/mTOR 比 值 降 低 （P＜0.01）。與缺氧/復(fù)氧模型組比較，雷諾嗪預(yù)處理組和雷帕霉素組H9C2 細(xì)胞中LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高（P＜0.01），p-mTOR/mTOR 比值明顯降低（P＜0.01）；雷諾嗪+渥曼青霉素組H9C2 細(xì)胞中LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ和p-mTOR/mTOR 比值與缺氧/復(fù)氧模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2 和表3。

圖2 各組H9C2 細(xì)胞中LC3、mTOR 和p-mTOR 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of LC3, mTOR,and p-mTOR proteins in H9C2 cells in various groups

表3 各組H9C2 細(xì)胞中LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ和p-mTOR/mTOR比值Tab.3 Ratios of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰand p-mTOR/mTOR in H9C2 cells in various groups (n=6，x±s）

3 討 論

研究［8］證實： 缺氧/復(fù)氧可以損傷心肌細(xì)胞膜，導(dǎo)致心肌酶LDH 大量釋放，細(xì)胞活性降低，因此，通過檢測培養(yǎng)基中LDH 水平可分析心肌細(xì)胞損傷程度。細(xì)胞活性降低25% 或以上可明確成功建立缺氧/復(fù)氧損傷模型［9-10］。本研究結(jié)果顯示：缺氧/復(fù)氧模型組H9C2 心肌細(xì)胞中細(xì)胞活性明顯降低約41%，LDH 釋放量明顯增多，說明成功建立缺氧/復(fù)氧損傷模型。

近年來，雷諾嗪在臨床試驗中已被證實對經(jīng)皮冠狀動脈介入治療后的患者有益處，可明顯改善心功能并減少心絞痛發(fā)作，復(fù)發(fā)性缺血和需要重復(fù)血運重建的患者也明顯減少［11］。本研究結(jié)果顯示：2 ～30 μmol·L－1雷諾嗪對H9C2 心肌細(xì)胞無毒性作用， 且 雷 諾 嗪 濃 度 為20 μmol·L－1時 使 缺 氧/復(fù) 氧H9C2 心肌細(xì)胞活性升高最為明顯。因此在探討雷諾嗪對缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)機制時，選定該濃度為最佳藥物濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

自噬是一種進(jìn)化保守并嚴(yán)格調(diào)控的生理現(xiàn)象，自噬可對受損物質(zhì)進(jìn)行降解和再利用以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在機體正常情況下，心臟的自噬維持著低水平，當(dāng)發(fā)生炎癥、營養(yǎng)缺乏和低氧等應(yīng)激情況時，自噬增強［12］。自噬在維持心肌細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用，研究［13-14］表明：在心臟疾病或機體應(yīng)激狀態(tài)下均可觀察到自噬活動的改變。因此，如何利用心肌細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機制降低心肌缺血再灌注損傷已成為當(dāng)今研究心肌缺血再灌注損傷的新焦點。

LC3 是自噬過程中必不可少的因子［15］，自噬被激活時，LC3 從胞質(zhì)形式LC3Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)槟そY(jié)合形式LC3Ⅱ，LC3 Ⅱ水平與自噬呈正相關(guān)關(guān)系；通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測可見，LC3 在胞質(zhì)中以彌散狀態(tài)分布，在自噬增強時，細(xì)胞中LC3 免疫熒光明顯增強，可觀察到呈熒光點聚集分布的LC3 明顯增多，因此，LC3 Ⅰ到LC3 Ⅱ轉(zhuǎn)換的檢測被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞自噬的判定。哺乳動物mTOR 是自噬的主要負(fù)性調(diào)節(jié)劑［16-19］，在自噬活動中起重要作用，對其抑制劑雷帕霉素較敏感。在營養(yǎng)物質(zhì)充足時，mTOR 被激活，自噬被阻斷，在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏時，mTOR 活性低，減弱了對自噬的抑制作用，自噬活動增強［20］。雷帕霉素是自噬的一種特異性激動劑，可通過抑制mTOR 通路，誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。研究［21］顯示：雷帕霉素在細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷過程中誘導(dǎo)自噬從而對H9C2 細(xì)胞起保護(hù)作用。PI3K-Akt-mTOR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是參與心肌缺血再灌注損傷過程的重要信號通路，渥曼青霉素即可作為PI3K 通路的有效抑制劑，也可作為自噬抑制劑通過抑制在自噬體形成中起作用的Ⅲ型PI3K 來發(fā)揮抑制自噬作用［7］。

本研究結(jié)果顯示：與正常對照組比較，缺氧/復(fù)氧模型組細(xì)胞中LC3 免疫熒光染色陽性細(xì)胞率升高，LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，p-mTOR/mTOR比值降低，說明缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬；與缺氧/復(fù)氧模型組比較，雷諾嗪預(yù)處理組細(xì)胞活性升高，LDH 釋放量減少，說明雷諾嗪對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2 心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用；雷諾嗪預(yù)處理組細(xì)胞中LC3 免疫熒光陽性細(xì)胞率升高，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高，mTOR 去磷酸化明顯，與雷帕霉素組結(jié)果一致，表明雷諾嗪誘導(dǎo)自噬增強，初步證實雷諾嗪可能通過抑制mTOR 在Ser2448 位點磷酸化而誘導(dǎo)自噬是其保護(hù)氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的作用機制之一。而加入渥曼青霉素預(yù)處理后，細(xì)胞活性和培養(yǎng)基中LDH 活性均與缺氧/復(fù)氧模型組相似，細(xì)胞受損傷嚴(yán)重，說明自噬抑制劑渥曼青霉素可以抑制雷諾嗪對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2 心肌細(xì)胞的保護(hù)作用； 且LC3 免疫熒光染色陽性細(xì)胞率、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值及p-mTOR/mTOR 比值等指標(biāo)均與缺氧/復(fù)氧模型組無差異，提示抑制自噬可抑制雷諾嗪對缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，進(jìn)一步推測雷諾嗪抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷作用可能與誘導(dǎo)細(xì)胞適度自噬有關(guān)聯(lián)。以上研究結(jié)果與既往研究［22-24］結(jié)論一致，適度調(diào)控自噬水平可有效減輕心肌缺血/再灌注損傷程度。

綜上所述， 雷諾嗪預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2 心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其作用機制可能與雷諾嗪抑制mTOR 蛋白磷酸化水平而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬有關(guān)聯(lián)。有關(guān)雷諾嗪對mTOR 通路上的其他分子的影響及其與自噬的作用機制還需進(jìn)一步研究。