哺乳動物乳鐵蛋白的研究進(jìn)展

文/郝文文 蘭欣怡

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院）

1 乳鐵蛋白概述

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，主要是由哺乳動物的乳房分泌的一種物質(zhì)，即外分泌腺和中性粒細(xì)胞分泌的具有鐵結(jié)合功能的陽離子糖蛋白[1]，分子量約80 kDa。體液中的乳鐵蛋白分為不含鐵、單三酸和雙三酸3 種形式[2]，是轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，Tf）家族的成員之一，在轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中乳鐵蛋白對鐵的親和力最強(qiáng)[3]。乳鐵蛋白具有8.9的等電點（pI），在低于其pI的pH環(huán)境下帶正電荷，可以與具有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)形成各種超分子結(jié)構(gòu)[4]。

乳鐵蛋白多分布在哺乳動物的淚液、唾液、血漿、膽汁、胰液以及小腸液中，少量存在于骨髓、血液中的中性粒細(xì)胞（PMN）、子宮內(nèi)膜及胎盤，人乳鐵蛋白還具有預(yù)防新生兒敗血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎[5]，保護(hù)新生兒免受感染的作用，同時乳鐵蛋白還能促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育和認(rèn)知[6]、刺激成骨細(xì)胞的增殖[7]和分化[8]、并抑制破骨細(xì)胞的形成[9]。

乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)較復(fù)雜，在生產(chǎn)方面，研究主要集中在人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白。王慧在論文中闡述，1939年，Sorensen首次在牛乳中一個未知的“紅色組分”中發(fā)現(xiàn)，牛乳鐵蛋白是一條由689 個氨基酸組成的單鏈多肽[10]。乳鐵蛋白的氨基酸序列，包含2 個葉，在每個葉上包含1 條聚糖鏈并結(jié)合1個Fe3+[11]，其表面是由堿性氨基酸構(gòu)成的糖胺多糖結(jié)合區(qū)域在靜電引力結(jié)合下帶有高度負(fù)電荷的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）[12]。

2 乳鐵蛋白的生物學(xué)功能

乳鐵蛋白具有多種生物功能，例如免疫調(diào)節(jié)功能，與鐵的結(jié)合能力，抗菌、抗病毒和抗氧化作用，鐵誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化保護(hù)，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力等。

2.1 免疫調(diào)節(jié)功能

免疫調(diào)節(jié)作用是乳鐵蛋白生物活性之一，可通過誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，促進(jìn)抗原特異T細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平，影響淋巴細(xì)胞增生等途徑發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能[13]。目前已證實乳鐵蛋白可促進(jìn)PMN、巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的貪食以及細(xì)菌內(nèi)的殺菌作用；促進(jìn)PMN聯(lián)合白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-28的放出；活化自然殺傷細(xì)胞（Natural Killer cell，NK）；抑制粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor，GM-CSF）的產(chǎn)生以及放出；抑制淋巴球的RNA翻譯；抑制混合淋巴球的IL-21、IL-22以腫瘤壞死因子（TNF）的放出；抑制補體活性化等[14]。

乳鐵蛋白在消化道酶水解作用下會釋放具有生物活性的肽段——乳鐵蛋白素[15]。，可促進(jìn)腸道免疫，并具有顯著作用，乳鐵蛋白與免疫球蛋白和其他保護(hù)性因子相協(xié)調(diào)參與局部分泌免疫，并主要作用于靶細(xì)胞和靶細(xì)胞表面非特異性受體上，同時減少細(xì)胞損傷和促進(jìn)損傷愈合作用，通過促進(jìn)PMN在受傷部分的吸附和聚集，增加粒細(xì)胞黏性，促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用，調(diào)節(jié)免疫球蛋白的分泌，參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫耐受力，抑制補體系統(tǒng)的激活或激活已有的補體途徑。大量試驗研究表明，乳鐵蛋白參與神經(jīng)營養(yǎng)因子通路、參與機(jī)體代謝調(diào)節(jié)[16]，促進(jìn)體液免疫。李娜等[17]對乳鐵蛋白免疫調(diào)節(jié)作用的研究表明，乳鐵蛋白具有明顯的抑制小鼠外周血單個核細(xì)胞增殖的作用，且乳鐵蛋白的抑制作用與其濃度存在相關(guān)性。當(dāng)乳鐵蛋白的濃度大于100 μg／mL時，抑制作用顯著；當(dāng)濃度為1 000 μg／mL時，抑制非常作用顯著[18]。

2.2 乳鐵蛋白與鐵的結(jié)合能力

乳鐵蛋白的許多生物活性與其鐵飽和度和在不同作用條件下對鐵的釋放能力有關(guān)，這是因為乳鐵蛋白中結(jié)合鐵的多少會影響其分子構(gòu)象。乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)雖然和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、血漿或乳漿中的轉(zhuǎn)鐵蛋白相似，但是其和鐵離子之間的親和力度較高，親和常數(shù)約1 025，親和能力是其他轉(zhuǎn)鐵蛋的260 倍[19]。因此，乳鐵蛋白通過穩(wěn)定還原態(tài)下的鐵離子，來提高腸黏膜細(xì)胞細(xì)胞對鐵的利用率，減少對腸道的刺激。與無鐵乳鐵蛋白對比，具有與鐵結(jié)合能力的乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)緊湊[20]，因為其每個氨基末端葉片和羧基末端葉片結(jié)構(gòu)中都含有鐵離子和碳酸氫根結(jié)構(gòu)，和鐵高度且可逆的結(jié)合（圖1）。不同來源的乳鐵蛋白在結(jié)構(gòu)上相似，但不完全相同，因此，在某些活性方面也存在差異。氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域中存在乳鐵蛋白中的鐵元素，之間的裂縫可以通過葉子的結(jié)構(gòu)變化而處于打開或關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)鐵離子和多肽鏈相互結(jié)合時，裂縫閉合。研究人員還根據(jù)乳鐵蛋白結(jié)合鐵離子的數(shù)量，把乳鐵蛋白分為鐵飽和型乳鐵蛋白、鐵半飽和型乳鐵蛋白和缺鐵型乳鐵蛋白3 種類型[21]。

乳鐵蛋白可以促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞對鐵元素的吸收，達(dá)到人體對鐵元素需要的平衡態(tài)，可治療妊娠缺鐵性貧血[22]。但是，如果人體缺乏鐵調(diào)節(jié)蛋白（IRPs）類的反饋回路，鐵可以持續(xù)向大腦運輸，可能會使大腦的鐵含量增加到病理水平，從而引發(fā)阿爾茨海默病和帕金森氏病等神經(jīng)退行性疾病[23]。

同時乳鐵蛋白還有抗氧化作用，乳鐵蛋白通過螯合Fe3+，減少羥自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH自由基）的產(chǎn)生，具有抗氧化作用。此外，乳鐵蛋白可以抑制硫代巴比妥酸（TBA）和丙二醛（MDA）的生成；非飽和乳鐵蛋白可以隔離自由鐵，保護(hù)糖蛋白不被氧化劑氧化[24]。

2.3 消炎及抗腫瘤作用

由于牛乳鐵蛋白能與鐵特異性結(jié)合，因其生物學(xué)特性而廣泛應(yīng)用于功能性和治療性產(chǎn)品，其中最重要的是抗菌活性[25]?；谄渑c鐵的結(jié)合能力強(qiáng)、可直接結(jié)合到微生物膜上、可阻止微生物附著在上皮細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞上3 個方面，而具有消炎作用。有研究人員發(fā)現(xiàn)，在有免疫球蛋白A（IgA）和溶菌酶存在的情況下，乳鐵蛋白的抗微生物感染能力會增強(qiáng)。袁渝萍等[26]研究發(fā)現(xiàn)重組人乳鐵蛋白能夠抑制幽門螺桿菌的生長及增殖，且能不同程度地抑制幽門螺桿菌毒力因子及蛋白的表達(dá)，降低幽門螺桿菌致病性。Angulo-Zamudio等[27]研究的乳鐵蛋白分解肺炎球菌生物膜發(fā)現(xiàn)，雖然乳鐵蛋白抑制了肺炎鏈球菌在人類呼吸細(xì)胞上的定植，但是不影響浮游細(xì)菌的生存能力。

圖1 乳鐵蛋白的分子結(jié)構(gòu)

研究表明，乳鐵蛋白可能會干預(yù)侵入性惡性腫瘤細(xì)胞，預(yù)防致命細(xì)菌穿透宿主組織[28]。同時乳鐵蛋白也是一種廣譜抗病毒劑，主要用于病毒感染的早期階段，其首先直接結(jié)合病毒顆粒，從而抑制其對靶細(xì)胞的入侵；其次根據(jù)靶細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步切斷病毒與靶細(xì)胞；最后抑制病毒進(jìn)入靶細(xì)胞后的自我復(fù)制過程，干擾病毒對靶細(xì)胞的吸附和侵襲，以此達(dá)到抗病毒作用。Gu Y等[29]通過高效液相色譜分離以及氧化物水平基底氧化測試后發(fā)現(xiàn)，牛乳鐵蛋白中提取的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制三肽低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（lowdensitylipoproteinreceptorrelatedprotein，LRP），具有抗氧化和抗炎及潛在的抗高血壓作用。乳鐵蛋白屬于非特異性免疫分子激活劑，可增強(qiáng)免疫細(xì)胞的殺傷作用，提高機(jī)體的抗病毒作用，抵抗病毒對人體引起的不良反應(yīng)[30]，還可以使重癥社區(qū)獲得性肺炎患者外周血中的白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞、降鈣素原等在一定的時間之內(nèi)產(chǎn)生下降趨勢[31]。乳鐵蛋白能促進(jìn)正常細(xì)胞增殖，但對癌細(xì)胞卻是起阻止而非刺激作用。乳鐵蛋白通過阻礙體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，并誘導(dǎo)改變細(xì)胞周期中一些重要調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)水平或活性，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。此外，乳鐵蛋白能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的功能而發(fā)揮抗血管生成的作用。最新研究表明，乳鐵蛋白能通過減少炎癥或誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，降低或修復(fù)由過氧化氫誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞損傷，研究者認(rèn)為乳鐵蛋白可作為一種預(yù)防和恢復(fù)腸道上皮損傷的潛在干預(yù)手段[32]，同時有些研究人員在妊娠母豬后期的飼料中加入了乳鐵蛋白，發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白不但可以提高幼崽初生重以及出生窩重，還可以提高仔豬的抗病能力[33]。

2.4 其他生物學(xué)功能

2.4.1 具有抗食物性病原體活性

食物性病原體阪崎腸桿菌（Cankobacter sakazakii）是一種依靠食物來傳播的病原體，主要影響新生兒健康?？茖W(xué)家根據(jù)評估天然和鐵飽和的牛乳鐵蛋白對非干燥和干燥Cankobacter sakazakii的抗菌活性。試驗結(jié)果表明，牛乳鐵蛋白對Cankobacter sakazakii的抗菌作用主要是鐵的螯合作用，通過與磷酸鹽緩沖液比較，發(fā)現(xiàn)天然牛乳鐵蛋白對非干燥Cankobacter sakazakii的抗菌活性在乳或乳清中顯著降低；但同樣條件下，對干燥Cankobacter sakazakii的抗菌性仍然存在[34]。

2.4.2 具有多種酶活性

在最新的研究結(jié)果中表明，牛乳鐵蛋白類似于人乳鐵蛋白，具有脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的活性。科學(xué)家運用了不同的方法，表明乳鐵蛋白擁有較高的過氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶和磷酸酶活性，且其蛋白酶活性是被鎂離子和鈣離子激活，其中具有ATP酶的活性的牛乳鐵蛋白的只占3/7。同時，研究人員Svetlana等[35]發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白制劑具有不同水平的金屬依賴性DNA酶和不依賴金屬的RNA酶活性。原有的分析顯示，脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的活性僅在對應(yīng)的同類乳鐵蛋白凝膠地方起作用。和人乳鐵蛋白對比，牛乳鐵蛋白對于人類腫瘤細(xì)胞具有較低的毒性。這些發(fā)現(xiàn)可以幫助理解這種多功能蛋白的多種生理功能，包括一些抵抗微生物和病毒感染的作用[36]。倘若生產(chǎn)時不注意衛(wèi)生，就會讓原本存在于牛乳中價值非常高的乳鐵蛋白因衛(wèi)生條件不加從而導(dǎo)致牛奶不能最大化利用，例如，埃塞俄比亞南部的阿瓦薩地區(qū)的奶牛所產(chǎn)的牛奶研究表明，分離出的金黃色葡萄球菌對青霉素G（PG）（10 μg），氨芐青霉素（AP）（10 μg）苯唑西林（Ox）（1 μg）產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，使得在人體中可以檢測到部分的金黃色葡萄球菌，從而使牛奶中營養(yǎng)物質(zhì)不能得到很好的表現(xiàn)[37]。

3 其他特性

3.1 過氧亞硝酸鹽對乳鐵蛋白的影響

以10：1摩爾比使用ONOO—（氧亞硝基陰離子）與酪氨酸處理，可以抑制天然乳鐵蛋白的所有抗菌活性。硝化產(chǎn)品中Fe3+使α-螺旋特性顯著降低，部分蛋白質(zhì)展開，使牛乳鐵蛋白保護(hù)細(xì)胞免受損能力下降。

同時，乳鐵蛋白的鐵結(jié)合能力在用過氧化亞酸鹽治療后也在減少，意味著乳鐵蛋白防止細(xì)胞損傷的能力下降。再通過LC-MS/MS光譜測定法來鑒定乳鐵蛋白肽硝化片段及包括在結(jié)合鐵區(qū)域的酪氨酸殘基Y92，這表明其通過過氧化亞酸鹽的翻譯后修改的乳鐵蛋白，可能作為一個重要的加劇感染的途徑[38]。

3.2 運用轉(zhuǎn)基因奶牛、山羊群，生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白

與其他動物相比，人乳鐵蛋白更適于人類食用，但一般情況下，人在非哺乳期不會產(chǎn)奶。隨著全球?qū)ε＃ㄑ颍┠讨破沸枨罅吭龆郲39]，科學(xué)家尋找合適的系統(tǒng)來進(jìn)行人乳鐵蛋白基因的異源表達(dá)。通過試驗研究表明，在常用的表達(dá)系統(tǒng)中，人乳鐵蛋白基因表達(dá)較為合適的器官是動物乳腺[40]，使用陽離子交換色譜凈化原生態(tài)山羊乳鐵蛋白，從而得到重組人乳鐵蛋白。同時，不同的分析方法，如分光光度法等揭示，重組人乳鐵蛋白是一個糖蛋白，且理化特征和原生態(tài)人乳鐵蛋白相似，抑菌活性相似，消化性能穩(wěn)定，鐵離子結(jié)合和釋放活力以及糖基化修飾相似[41]，并可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化[42]。

在SD大白鼠試驗中，經(jīng)科研人員長時間喂養(yǎng)得知，對SD大白鼠飼喂人乳鐵蛋白全乳粉尚未出現(xiàn)安全問題，并且乳鐵蛋白可能通過提高骨保護(hù)素（OPG）/細(xì)胞核因子KB受體活化因子配體（RANKL）正確比值，增加骨量和減少骨損失[43]，通過促進(jìn)骨形成進(jìn)一步維持骨代謝平衡，同時還可提高SD大白鼠機(jī)體鐵的營養(yǎng)狀況[44]，這意味著其可作為一個有前途的生物制藥和食品補充劑[45]。

3.3 鹽酸四環(huán)素與牛乳鐵蛋白

根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)和分子嵌合進(jìn)一步顯示靜電力力量，牛乳鐵蛋白和鹽酸四環(huán)素結(jié)合時需要使用到范德華力和氫鍵結(jié)合力。通過圓二色光譜等方法證實了牛乳鐵蛋白確實和鹽酸四環(huán)素有聯(lián)系，并引起了牛乳鐵蛋白的構(gòu)造變化，再通過對牛乳鐵蛋白表面的疏水性變化的分析，進(jìn)一步研究牛乳鐵蛋白和鐵離子之間的捆綁力是否是因鹽酸四環(huán)素對蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生了影響，從而使得捆綁力發(fā)生了變化。最后發(fā)現(xiàn)，牛乳鐵蛋白和鹽酸四環(huán)素之間相互作用，且兩者之間的結(jié)合力非常強(qiáng)[46]。

4 乳鐵蛋白的檢測方法

根據(jù)現(xiàn)如今資料顯示，對乳鐵蛋白的檢驗方法主要有4 種：毛細(xì)管電泳[47]、高效液相色譜法[48]、分光光度法[49]、酶聯(lián)免疫吸附法[50]。

4.1 毛細(xì)管電泳

近些年來，有科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)用毛細(xì)管電泳可以高效篩選牛乳鐵蛋白適體[51]，通過采用不同測序深度的高輸出和中輸出2 種方法進(jìn)行新一代測序。他們通過建立動態(tài)涂層毛細(xì)管電泳快速檢測乳鐵蛋白含量的方法，分析該方法對乳鐵蛋白檢測及純度的驗證是否有效[52]。此外，通過分子動力學(xué)模擬分析結(jié)合位點、相互作用力和結(jié)合自由能，來驗證候選分子和牛乳鐵蛋白的結(jié)合力。多次試驗后發(fā)現(xiàn)，樣品奶粉的牛乳鐵蛋白檢測結(jié)果與標(biāo)示濃度基本一致[53]。

4.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法可以用來測定牛乳鐵蛋白在無菌乳制品、發(fā)酵乳制品、嬰幼兒配方食品等中的含量，同時還能測定不同品種牛奶中乳鐵蛋白的含量。由于高效液相色譜法沒有長時間的預(yù)處理以及分離層次，添加簡單的預(yù)處理步驟是為了移除酪蛋白家族的脂肪和蛋白質(zhì)，使得不同品種的乳汁對乳鐵蛋白的洗滌程度不同，乳清中乳鐵蛋白的洗脫量也不同，雖然對于有些樣本如綿羊、奶牛及驢的乳汁所展示的峰的分辨率比較滿意，但是觀測山羊和人類的乳汁時，其峰分辨率會被其他峰干涉，但是乳鐵蛋白的定量對所有樣本都是可能的。通過改進(jìn)的肝素親和層析柱高效液相色譜法能使被測物種的乳汁樣品中乳鐵蛋白的測定成為可能，即可用于日常分析，也可作為一種定性篩選，來確保乳鐵蛋白是否存在[54]。先在pH=8的磷酸鹽緩沖液中將牛乳鐵蛋白提取出來，在肝素親和層析柱中洗滌，并在280 nm下使用C4層析柱高效液相色譜法檢測和二極管陣列檢測器檢測。該方法提供了一個線性監(jiān)測范圍。10～1 000 μg/mL的定性限樣品——0.6 mg/100 g液體樣品和3.0 mg/100 g固體樣品，以及定量限樣品——2.0 mg/100 g液體樣品和10.0 mg/100 g固體樣品。此外，該方法讓76%～96%的樣品有更好的回收率，具有容易處理，靈敏度高以及精確度良好，回收率較高以及檢測廉價的優(yōu)勢[55]。

根據(jù)李莉等[56]對比分析過乳鐵蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒法和高效液相色譜法對嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量進(jìn)行測定結(jié)果，最后發(fā)現(xiàn)這兩種方法的測定結(jié)果無顯著性差異，都可以被用來測定嬰幼兒食品中乳鐵蛋白含量。

4.3 分光光度法

分光光度法可以用來測定乳鐵蛋白濃度，由于該方法對儀器設(shè)備的要求較低，因此，可以迅速測出乳鐵蛋白的含量，但其準(zhǔn)確度不高[57]。通常用于工廠分離提純過程中的快速檢測或是分析對檢測結(jié)果準(zhǔn)確度要求不高的樣品分析。

4.4 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法靈敏度較高，操作較簡單[58]，可以快速的檢測出奶粉中的乳鐵蛋白含量[59]。

5 總結(jié)

乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，能夠和鐵離子親密結(jié)合，同時還具有抗菌、抗病毒和抗氧化，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力等作用，因而被運用在醫(yī)療、食品、藥品等諸多領(lǐng)域。目前乳鐵蛋白提取的量較少，但未來可以通過研究新方法提取出比率更多的乳鐵蛋白。因此，乳鐵蛋白的發(fā)展前景非常廣闊，未來的研究方向主要是如何提取出更優(yōu)質(zhì)的乳鐵蛋白應(yīng)用于人類健康領(lǐng)域。