果蔬發(fā)酵酒中高級(jí)醇的研究進(jìn)展

柳新宇，石韶琦，武宇昊，李寧陽

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

高級(jí)醇是指含有2 個(gè)碳原子以上的一類醇的統(tǒng)稱，沸點(diǎn)高，不溶于水，但溶于酒精，酒精度低時(shí)析出呈油狀，俗稱“雜醇油”[1]。這類物質(zhì)是酒類發(fā)酵過程中的主要副產(chǎn)物，同時(shí)也是酒體主要的呈香物質(zhì)，能提升酒的協(xié)調(diào)性和濃郁感，酒中約50%的香氣由這類物質(zhì)提供。高級(jí)醇結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在人體中代謝緩慢，含量過高時(shí)會(huì)對(duì)人體造成一定的毒副作用，使人產(chǎn)生面紅耳赤、心跳加速、惡心嘔吐、頭暈頭痛等不良反應(yīng)，也就是俗稱的“上頭”，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)中毒、出現(xiàn)幻覺等嚴(yán)重的身體損害現(xiàn)象[2-3]，因此控制酒中高級(jí)醇含量有重要的意義。我國(guó)一些酒類生產(chǎn)廠家有較嚴(yán)格的高級(jí)醇限量標(biāo)準(zhǔn)，大多按照GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的有關(guān)規(guī)定，以每100 mL 飲料酒中高級(jí)醇含量不超過0.15 g（以戊醇計(jì)）或0.3 g（以異丁醇和異戊醇計(jì)）來評(píng)判酒中高級(jí)醇含量是否符合標(biāo)準(zhǔn)[4]。加入WTO 前，我國(guó)酒類的高級(jí)醇限量為2.0 g/L，但進(jìn)口酒中的高級(jí)醇含量均高于此標(biāo)準(zhǔn)，為了使進(jìn)口酒順利進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，我國(guó)不得不刪除了《蒸餾酒及其配制酒》GB 2757—2012 修訂版中關(guān)于高級(jí)醇限量的部分，但從把身體健康擺在首位的角度考慮，控制酒類產(chǎn)品中高級(jí)醇的含量具有一定的意義。

高級(jí)醇是釀酒過程中酵母合成細(xì)胞蛋白質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物[5]，主要由兩種途徑合成，即生物合成途徑和糖代謝合成途徑，在釀酒過程中，可以通過改變發(fā)酵的工藝條件，來抑制高級(jí)醇的生成，本文主要總結(jié)了高級(jí)醇的形成路徑、測(cè)定方法、影響高級(jí)醇生成的因素及控制方法，為優(yōu)質(zhì)酒類的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 酒中高級(jí)醇的形成路徑

1.1 氨基酸降解代謝路徑

顧國(guó)賢[6]闡述了氨基酸降解生成高級(jí)醇的途徑，即發(fā)酵過程中氨基酸通過轉(zhuǎn)氨基作用形成α-酮酸，再經(jīng)過脫羧、還原生成比原氨基酸少一個(gè)碳原子的高級(jí)醇[6-7]。特定的氨基酸會(huì)形成特定的高級(jí)醇，例如纈氨酸生成異丁醇，亮氨酸生成異戊醇，蘇氨酸生成異丙醇，異亮氨酸生成活性戊醇等[8]。

1.2 糖代謝合成路徑

顧國(guó)賢[6]闡述了由糖代謝通過丙酮酸合成高級(jí)醇的途徑，即糖代謝合成路徑。酵母通過糖類物質(zhì)形成丙酮酸，丙酮酸在乙酰羥酸合酶的作用下為氨基酸降解途徑提供骨架，在其合成代謝階段生成α-酮酸中間體，然后經(jīng)脫羧、還原生成相應(yīng)的高級(jí)醇[5,9]。

2 高級(jí)醇的測(cè)定方法

2.1 比色法

2.1.1 分光光度計(jì)法

分光光度計(jì)法是指在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)，利用被測(cè)物質(zhì)的吸光度值對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析的一種方法。在高級(jí)醇含量的測(cè)定中，本法是利用高級(jí)醇（正丙醇除外）在濃硫酸的作用下脫水生成不飽和烴，進(jìn)而與對(duì)二甲基苯甲醛發(fā)生反應(yīng)生成橙黃色物質(zhì)，該物質(zhì)在520 nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰，且含量與吸收值的比值符合朗伯-比爾定律，故可用此法進(jìn)行定量分析[10]。甄會(huì)英等[11]通過對(duì)顯色后的高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和蘋果酒樣進(jìn)行可見光區(qū)的全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)蘋果酒中的高級(jí)醇在477 nm 下有最大吸收峰；徐文華等[12]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高級(jí)醇在495 nm處有最大吸收峰。此方法操作簡(jiǎn)便，成本低，但是存在顯色不穩(wěn)定、重現(xiàn)性差及線性關(guān)系不理想等問題[5]，對(duì)高級(jí)醇只能定量并不能定性分析，且由于高級(jí)醇種類復(fù)雜，各醇類顯色強(qiáng)度不同，故其結(jié)果比用氣相色譜測(cè)得的結(jié)果偏低[13]。每種酒中高級(jí)醇種類不同，會(huì)導(dǎo)致最大吸收峰不同，故常需要進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描確定最佳波長(zhǎng)，增加了操作的復(fù)雜性。

2.1.2 酶標(biāo)儀比色法

酶標(biāo)儀比色法是基于朗伯-比爾定律實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)化合物的定量分析的一種檢測(cè)方法，其工作原理、主要結(jié)構(gòu)與光電比色計(jì)幾乎相同[14]。袁國(guó)億等[15]采用酶標(biāo)儀法，測(cè)定濁米酒在408、450、500、520 nm 下1 h 內(nèi)的吸光度值，分析得出其標(biāo)準(zhǔn)曲線R2受檢測(cè)波長(zhǎng)和檢測(cè)時(shí)間的影響；再將其結(jié)果與氣相色譜所測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)為520 nm，檢測(cè)時(shí)間為15 min 時(shí)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.001 5，變異系數(shù)小于3.1%，故酶標(biāo)儀比色法重現(xiàn)性好、精密度高。但通過與氣相色譜法對(duì)比發(fā)現(xiàn)，酶標(biāo)儀比色法結(jié)果會(huì)受高級(jí)醇含量的影響，且無法直接對(duì)酒中的高級(jí)醇進(jìn)行單一定量。

2.2 氣相色譜法

氣相色譜法是一種以氣體為流動(dòng)相的色譜法，分為內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法，具有選擇性高、效能高、檢測(cè)限低、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[16]，能對(duì)酒中的高級(jí)醇進(jìn)行定性和定量分析，且結(jié)果較分光光度計(jì)法更準(zhǔn)確，但氣相色譜操作復(fù)雜、前處理較多且機(jī)器運(yùn)行及維修費(fèi)用均較高，不適合在生產(chǎn)過程中進(jìn)行快速檢測(cè)。其中外標(biāo)法要求標(biāo)準(zhǔn)物與被測(cè)組分為同一種物質(zhì)且濃度接近，并且需要在試驗(yàn)操作過程中嚴(yán)格控制進(jìn)樣量，以提高試驗(yàn)結(jié)果的精確度[16]。內(nèi)標(biāo)法較外標(biāo)法更準(zhǔn)確，不受進(jìn)樣量誤差的影響，但也存在內(nèi)標(biāo)物易在樣品里混合不均勻或與樣品組分發(fā)生反應(yīng)、內(nèi)標(biāo)物純度易受影響等問題。黃建明等[17]采用外標(biāo)法定量測(cè)定黃酒中的高級(jí)醇，試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01%～1.03%；甄會(huì)英等[18]在葡萄酒的測(cè)定中，試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.012 0%～1.070 7%；董永鑫等[19]在石榴葡萄酒的測(cè)定中，得出試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)偏差為2.179 7%～3.212 5%，由此可知?dú)庀嗌V法精密度好、準(zhǔn)確度高。

2.2.1 填充柱氣相色譜法

填充柱氣相色譜法以惰性氣體為載氣，根據(jù)不同物質(zhì)在固定相中的停留時(shí)間不一致，并具有一定的保留時(shí)間，利用保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較來定性，利用峰面積或峰高來定量[5]。李惠民等[20]采用401 微球填充柱對(duì)桑葚酒中的醇類物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)出峰時(shí)間間隔長(zhǎng)且基線分離，對(duì)試樣分離效果好，但填充柱現(xiàn)在使用較少，多與儀器不適配，使用陳舊儀器，效果不佳且手動(dòng)積分、計(jì)算繁瑣。

2.2.2 毛細(xì)管柱氣相色譜法

毛細(xì)管柱氣相色譜法滲透性好、柱效高且進(jìn)樣量少，分析時(shí)間短。閔春艷[21]采用HP-INNOWax 毛細(xì)管氣相色譜柱測(cè)定鹿血酒中的高級(jí)醇，發(fā)現(xiàn)其分離良好，并且在一定濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，檢出限為1.6 μg/mL；彭松等[22]采用毛細(xì)管柱TG-WAXMS 測(cè)定棗酒中高級(jí)醇的含量，發(fā)現(xiàn)其標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，最低檢出限為0.002～0.007 mg/mL，且操作簡(jiǎn)單、分離效果好。

2.2.3 頂空固相微萃取-氣相色譜法

固相微萃取法是將待測(cè)樣品與熱力學(xué)平衡的蒸汽放置在一個(gè)密閉系統(tǒng)中進(jìn)行，廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性及半揮發(fā)性有機(jī)物的分析，該方法無需有機(jī)溶劑、操作簡(jiǎn)單。劉拉平等[23]采用固相微萃取方法分析獼猴桃酒中的香氣成分，該方法在縮短樣品處理時(shí)間的同時(shí)保留了大量的待測(cè)香氣組分，極大地提高了靈敏度與準(zhǔn)確性。于洪梅[24]使用固相微萃取的方法測(cè)定啤酒中的高級(jí)醇，并比較了HP-5MS、TG-WAXMS、TG-35MS 三種色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)TG-WAXMS 色譜柱分離效果好，靈敏度高。

3 影響高級(jí)醇含量的因素及其控制方法

3.1 工藝條件

3.1.1 發(fā)酵溫度

酵母菌易受溫度的影響，在一定溫度范圍內(nèi)，酵母菌的生長(zhǎng)代謝能力隨發(fā)酵溫度的升高而增強(qiáng)，進(jìn)而增強(qiáng)了高級(jí)醇生成相關(guān)轉(zhuǎn)化酶的活力，因此由氨基酸合成路徑和糖代謝合成路徑所產(chǎn)生的高級(jí)醇含量增加。相反若發(fā)酵溫度過低，酵母的生長(zhǎng)代謝能力減弱，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，則會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵不完全，影響最終酒類品質(zhì)[25]。羅惠波等[25]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高級(jí)醇含量在20 ℃以下時(shí)較低，在25 ℃以上時(shí)顯著增加；周揚(yáng)等[26]在百香果酒釀造中發(fā)現(xiàn)20 ℃時(shí)高級(jí)醇含量最低；朱會(huì)霞[27]在葡萄酒釀造時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度超過22 ℃會(huì)加快發(fā)酵速度，發(fā)酵提前終止，最終生成的酒類酒精度低、高級(jí)醇含量高。溫度較低時(shí)，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)且發(fā)酵徹底，最終生成的酒類酒精度高、高級(jí)醇含量低，最終通過實(shí)驗(yàn)得出發(fā)酵溫度控制在20 ℃較為合適。因此可知，發(fā)酵溫度對(duì)高級(jí)醇的生成有著顯著影響，適當(dāng)降低發(fā)酵溫度有利于抑制高級(jí)醇的生成。

3.1.2 初始pH 值

酒液初始pH 值會(huì)直接影響酵母菌的活性程度，從而影響了酵母的代謝活動(dòng)，同時(shí)酵母菌的活性決定了酒液的發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)短、發(fā)酵程度等，進(jìn)而影響了酒中高級(jí)醇的生成。羅惠波等[25]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高級(jí)醇的含量與桑葚汁的初始pH 值成正比。當(dāng)初始pH 值>4.0 時(shí)，高級(jí)醇的含量明顯增加；pH 值<3.5 時(shí)，高級(jí)醇的含量明顯降低；于濤[28]在蘋果酒的釀造中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH≥3.0 時(shí)，高級(jí)醇的含量與初始pH 值成正比；當(dāng)初始pH 值≤3.0 時(shí)，高級(jí)醇和初始pH 值成反比，在pH 為2.5 時(shí)，高級(jí)醇的生成量最低，為79.33 mg/L；周揚(yáng)等[26]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高酸組的百香果酒高級(jí)醇含量更低。由此可知，降低酒液初始pH 值，有利于抑制高級(jí)醇的生成，究其原因可能是酸度影響果膠酶的活性，從而間接抑制了高級(jí)醇的生成[29-31]，因此，適當(dāng)降低pH 值能有效抑制高級(jí)醇的生成，減少酒中高級(jí)醇的含量。

3.1.3 起始糖度

釀酒是利用糖和酵母作用產(chǎn)生二氧化碳和酒精，每種果蔬固有糖度不同，故需要調(diào)節(jié)合適的糖度使發(fā)酵順利且達(dá)到目標(biāo)所需的酒精度。高級(jí)醇合成的兩條路徑屬于競(jìng)爭(zhēng)抑制關(guān)系，糖量過多，會(huì)抑制氨基酸合成路徑，促進(jìn)了糖代謝路徑生成高級(jí)醇[28]，從而增加了高級(jí)醇的含量，故控制初始糖度對(duì)高級(jí)醇的生成具有重要意義。于濤[28]在蘋果酒的釀造中發(fā)現(xiàn)高級(jí)醇含量隨糖度的增大而增大，當(dāng)糖度≤16%時(shí)，高級(jí)醇的生成量較少；楊東升等[31]在香蕉酒的釀造中，發(fā)現(xiàn)起始糖度對(duì)甲醇含量影響較小，但對(duì)異丁醇和異戊醇含量影響顯著，高級(jí)醇含量在起始糖度為22%時(shí)最低。張麗芝[32]在棗酒的釀造中通過比較添加濃縮棗汁、葡萄糖和蔗糖發(fā)酵后生成的高級(jí)醇含量，發(fā)現(xiàn)添加濃縮棗汁的酒液高級(jí)醇生成量最低。由此可知，起始糖度對(duì)酒中高級(jí)醇的含量有著一定的影響，降低外源糖量添加，利用果蔬自身的糖來發(fā)酵能有效降低高級(jí)醇含量。

3.2 酵母菌種類

果蔬發(fā)酵酒均在酵母菌的作用下進(jìn)行發(fā)酵，一般采用純種發(fā)酵或自然發(fā)酵的方法。目前我國(guó)沒有果酒專用酵母，大多果酒的釀造使用的是釀酒酵母，也有部分人對(duì)酵母進(jìn)行篩選，進(jìn)而獲取更合適的酵母種類，通過相關(guān)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)酵母種類對(duì)酒中高級(jí)醇的含量有很大影響。鄒波等[33]在棗酒的釀造中通過接種4 種不同的酵母發(fā)現(xiàn)，不同酵母發(fā)酵的棗酒高級(jí)醇含量存在明顯差異，其中活性干酵母BO213 高級(jí)醇生成量最低；蔣成等[34]在無花果酒的釀造中也獲得了同樣的結(jié)果。因此，不同種類的酵母能改變酒中高級(jí)醇的含量，選擇合適的酵母能有效減少高級(jí)醇的產(chǎn)生。

3.3 酵母接種量

在一定范圍內(nèi)，酵母的接種量與發(fā)酵時(shí)間、酒精度成正比。增加酵母的接種量可以抑制細(xì)胞的增殖從而加快發(fā)酵速度，氨基酸代謝活動(dòng)會(huì)隨著酵母菌的生長(zhǎng)代謝受到抑制而減弱，從而減少了氨基酸合成路徑生成的高級(jí)醇含量[29]。羅惠波等[25]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高級(jí)醇的含量隨酵母接種量的增加而增加，高級(jí)醇含量在酵母菌接種量為4.0×106cell/mL 時(shí)最高，然后隨酵母接種量的增加而降低；于濤[28]在蘋果酒釀造中發(fā)現(xiàn)，高級(jí)醇含量在酵母接種量9%時(shí)最低，為169.74 mg/L；朱會(huì)霞[27]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，增加酵母菌接種量可降低高級(jí)醇含量，在接種量為3.5×107cfu 時(shí)高級(jí)醇含量最低，但是繼續(xù)增大酵母接種量高級(jí)醇含量不增反減[27]。由此可知，適當(dāng)?shù)脑黾咏湍附臃N量可在一定程度上降低高級(jí)醇含量。

3.4 可同化氮素

可同化氮素是酵母在酒精發(fā)酵中優(yōu)先利用的氮源，例如銨鹽、尿素、α-氨基酸（脯氨酸除外）和小分子多肽等，添加可同化氮素對(duì)酒中高級(jí)醇的生成有顯著影響[35]。傅紅雪[36]在藍(lán)莓酒的釀制中，加入345 mg/L 磷酸氫銨和0.336 mg/L 硫胺素，試驗(yàn)結(jié)果表明高級(jí)醇含量下降了106.36 mg/L。VIDAL 等[37]發(fā)現(xiàn)，在可同化氮素含量低的甘蔗汁中添加一定量的銨態(tài)氮會(huì)降低高級(jí)醇的含量。孫時(shí)光等[38]在桑葚酒的釀制中，加入磷酸二氫銨，高級(jí)醇含量下降7.64%；加入丙氨酸，高級(jí)醇含量下降6.73%；加入精氨酸，高級(jí)醇含量下降6.33%。張斌等[39]在荔枝酒的釀制中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入100 mg/L 谷氨酸時(shí)，高級(jí)醇含量最低。此外，楊生智等[40]在小曲白酒中添加0.4%碳酸氫銨，高級(jí)醇含量下降了19%。由此可知，可同化氮素對(duì)酒中高級(jí)醇的含量有較大影響，合理控制可同化氮素能有效抑制高級(jí)醇的生成，且此類物質(zhì)能被酵母有效利用，可成為未來工業(yè)化生產(chǎn)酒類時(shí)的氮源補(bǔ)償劑。

3.5 其他添加物

在釀酒過程中，除了主要原料，通常還會(huì)添加一些其他物質(zhì)（如酶制劑）一同進(jìn)行發(fā)酵，促進(jìn)果蔬細(xì)胞壁的破碎，增加出汁量。同時(shí)也會(huì)加入SO2進(jìn)行抑菌，但是硫含量對(duì)高級(jí)醇的生成也有一定的影響。孫時(shí)光等[38]在桑葚酒的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵1 d 后加入糖化酶、果膠酶、纖維素酶三種制劑，均能有效抑制桑椹果酒中高級(jí)醇的生成，分別使高級(jí)醇含量下降了5.95%、6.74%、9.01%。同時(shí)他還發(fā)現(xiàn)，加入20 mg/L K+會(huì)使高級(jí)醇含量下降8.66%，加入40 mg/L Ca2+使高級(jí)醇含量下降4.42%；朱會(huì)霞[27]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高級(jí)醇的含量隨SO2添加濃度的增加而降低，在添加100 mg/L SO2時(shí)高級(jí)醇含量最低（176.18 mg/L）。由此可知，外源添加物對(duì)酒中高級(jí)醇的生成有一定影響。

3.6 催陳處理

催陳技術(shù)是指借用外力來加快老熟過程，以調(diào)節(jié)醇酸酯的比例，因此可以影響高級(jí)醇的含量。鄭新華[4]通過對(duì)半成品青梅酒進(jìn)行超聲、微波、臭氧處理后，發(fā)現(xiàn)高級(jí)醇含量均有所下降。實(shí)驗(yàn)得出半成品青梅酒在45 kHz、360 W 頻率下超聲30 min 后，高級(jí)醇含量降低19.63%；用3.6 mg/L 臭氧作用8 min 后，高級(jí)醇含量下降了25.34%；在微波中低檔火力處理2 min 后，高級(jí)醇含量下降了24.93%。因此，對(duì)半成品酒采取一定的物理技術(shù)處理進(jìn)行催陳，亦能有效降低酒中高級(jí)醇的含量。

4 展望

綜上所述，酒中高級(jí)醇的生成主要由氨基酸分解代謝和糖代謝產(chǎn)生，兩條合成路徑在發(fā)酵過程中是同時(shí)存在的，降低高級(jí)醇含量主要從抑制這兩條路徑入手。通過控制工藝條件，例如發(fā)酵溫度、初始pH 值、起始糖度等來降低酒中高級(jí)醇含量，亦可以通過選擇適宜的菌種及接種量、合適的外源添加物，或采取一定的物理技術(shù)進(jìn)行催陳處理等，均有利于降低酒中高級(jí)醇的含量。未來，可以主要把這些方法作為降低酒中高級(jí)醇含量的主要研究方向。

果酒釀造在我國(guó)有悠久的歷史，但是果酒中高級(jí)醇的含量一直沒有明確的限制，故研究果酒中高級(jí)醇的含量對(duì)提高果酒品質(zhì)有重要意義。由于果酒的原材料種類廣泛，自身的含糖量及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和需要控制的方面不同，致使果酒在釀造工藝上有所不同。果酒目前沒有專用酵母，對(duì)于果酒中高級(jí)醇的控制方法也尚未明確，形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，故在未來果蔬發(fā)酵酒的生產(chǎn)發(fā)展中，需要根據(jù)原材料的不同，在保證酒感官良好的情況下根據(jù)實(shí)際情況選擇相應(yīng)的控制措施，從而制作出高品質(zhì)、低高級(jí)醇含量的優(yōu)質(zhì)果蔬發(fā)酵酒。