食品大腸菌群檢驗(yàn)中培養(yǎng)基驗(yàn)證方法的探討

謝甜 陳亞

摘 要：培養(yǎng)基的質(zhì)量直接關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實(shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行培養(yǎng)基的驗(yàn)證具有極其重要的意義;GB 4789.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)方法主要涉及結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）這3種培養(yǎng)基，通過對(duì)這3種培養(yǎng)基的驗(yàn)證，評(píng)價(jià)培養(yǎng)基是否滿足實(shí)驗(yàn)需要;并對(duì)可能造成培養(yǎng)基驗(yàn)證結(jié)果不準(zhǔn)確的因素進(jìn)行分析討論。

關(guān)鍵詞：食品;大腸菌群;培養(yǎng)基;驗(yàn)證

培養(yǎng)基是微生物檢驗(yàn)中的主要耗品和材料。從培養(yǎng)基自身的質(zhì)量來看，不同生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品，甚至同一廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品都會(huì)存在差異;依據(jù)GB/T 27050-2008《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》，對(duì)培養(yǎng)基的供應(yīng)企業(yè)進(jìn)行評(píng)價(jià)后選擇合格的供應(yīng)商，這是培養(yǎng)基購買過程中的重要步驟。做好培養(yǎng)基和試劑的檢查工作，對(duì)確保微生物的生長(zhǎng)、分離、鑒定與檢驗(yàn)結(jié)果的正確性具有關(guān)鍵性的作用。因此，需要對(duì)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量進(jìn)行檢查，以控制好培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量[1]。培養(yǎng)基驗(yàn)證是微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，驗(yàn)證結(jié)果直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和質(zhì)量，而大腸菌群是最為常見的檢測(cè)項(xiàng)目也是必檢項(xiàng)目，與人們的飲食健康息息相關(guān)，因此大腸菌群檢測(cè)的準(zhǔn)確性至關(guān)重要[2]。參照GB 4789.28-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》[3]，從食品大腸菌群檢驗(yàn)中培養(yǎng)基的驗(yàn)證入手，闡述培養(yǎng)基驗(yàn)證的具體操作流程，為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的質(zhì)量控制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

1.1.1 待驗(yàn)證培養(yǎng)基

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA），批號(hào)：190812，廠家：北京陸橋技術(shù)股份有限公司;月桂基磺酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST），批號(hào)：180509，廠家：北京陸橋技術(shù)股份有限公司;煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB），批號(hào)：190517，廠家：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 其他培養(yǎng)基（已驗(yàn)證合格的培養(yǎng)基）

營(yíng)養(yǎng)肉湯，批號(hào)：190829，北京陸橋技術(shù)股份有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂，批號(hào)：190422，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 菌株信息

大腸埃希氏菌CICC 10305，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;糞腸球菌CICC 23658，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864，KWIKSTIK。

1.3 儀器與設(shè)備

BSP-400L培養(yǎng)箱（S.15.17），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（S.17.3），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

2 培養(yǎng)基驗(yàn)證方法

2.1 培養(yǎng)基制備

將VRBA培養(yǎng)基制好后倒入平皿，冷卻備用。將LST培養(yǎng)基分裝試管，每管10 mL;將BGLB培養(yǎng)基分裝試管，每管10 mL。滅菌后備用。

2.2 工作菌懸液制備

菌懸液A：將大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌和糞腸球菌菌株分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，36 ℃下培養(yǎng)24 h，即得3種工作菌懸液A。

菌懸液B：菌懸液A中的這3種工作菌懸液分別稀釋10、100、1 000與10 000倍，制備濃度為105～107 CFU/mL的菌懸液作為工作菌懸液;大腸埃希氏菌106 CFU/mL為工作菌懸液適宜濃度。弗氏檸檬酸桿菌，106 CFU/mL為工作菌懸液適宜濃度。糞腸球菌105 CFU/mL為工作菌懸液適宜濃度。

2.3 VRBA培養(yǎng)基驗(yàn)證

2.3.1 生長(zhǎng)率測(cè)試

接種：用1 μL接種環(huán)分別挑取菌懸液A中的大腸埃希氏菌菌懸液和弗氏檸檬酸桿菌菌懸液各一環(huán)在VRBA平板上劃線，各接種兩個(gè)平板，按圖1所示;在36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

計(jì)算：每條有比較稠密菌落生長(zhǎng)的劃線則生長(zhǎng)指數(shù)G為1;僅一半的線有稠密菌落生長(zhǎng)，則G為0.5;若劃線上沒有菌落生長(zhǎng)、生長(zhǎng)量少于劃線的一半或菌落生長(zhǎng)微弱，則G為0;記錄每個(gè)平板的得分總和便得到G總。

VRBA生長(zhǎng)率測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。

大腸埃希氏菌（平均值）G總=7.5（要求G總≥6），特征性反應(yīng)：大腸埃希氏菌有沉淀環(huán)的紫紅色菌落。

弗氏檸檬酸桿菌（平均值）G總=7（要求G總≥6）。

2.3.2 選擇性測(cè)試

接種：用1 μL接種環(huán)取菌懸液A中的糞腸球菌工作菌懸液1環(huán)，在VRBA平板上劃線，如圖2，同時(shí)接種兩個(gè)平板。在36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。

計(jì)算：每條有比較稠密菌落生長(zhǎng)的劃線則生長(zhǎng)指數(shù)G為1;僅一半的線有稠密菌落生長(zhǎng)，則G為0.5;若劃線上沒有菌落生長(zhǎng)、生長(zhǎng)量少于劃線的一半或菌落生長(zhǎng)微弱，則G為0;記錄每個(gè)平板的得分總和便得到G總1。

VRBA選擇性測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果：糞腸球菌（平均值）G總1=3;（要求G總1<5）。

2.4 LST培養(yǎng)基驗(yàn)證

2.4.1 測(cè)試

用1 μL接種環(huán)各取一環(huán)菌懸液B直接接種到LST培養(yǎng)基中，在36 ℃培養(yǎng)48 h。

2.4.2 結(jié)果解釋

目測(cè)濁度值評(píng)估培養(yǎng)基，0表示無混濁;1表示很輕微混濁;2表示嚴(yán)重的混濁。

生長(zhǎng)率：大腸埃希氏菌濁度值=2（產(chǎn)氣）;弗氏檸檬酸桿菌濁度值=2（產(chǎn)氣）。

選擇性：糞腸球菌濁度值=0。

2.5 BGLG培養(yǎng)基驗(yàn)證

方法與LST培養(yǎng)基驗(yàn)證完全相同。

3 結(jié)論與分析

3.1 VRBA培養(yǎng)基驗(yàn)證結(jié)論

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)要求

生長(zhǎng)率測(cè)試：大腸埃希氏菌G≥6，且在VRBA平板上有特征性反應(yīng);選擇性測(cè)試：弗氏檸檬酸桿菌G≥6，糞腸球菌G<5。

3.1.2 結(jié)論

VRBA培養(yǎng)基驗(yàn)證結(jié)果滿足上述要求，驗(yàn)證結(jié)論合格。

3.2 LST培養(yǎng)基驗(yàn)證結(jié)論

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)要求

大腸埃希氏菌：混濁度為2，且管內(nèi)有氣體;弗氏檸檬酸桿菌：混濁度為2，且管內(nèi)有氣體;糞腸球菌：濁度0（不生長(zhǎng)）。

3.2.2 結(jié)論

LST培養(yǎng)基驗(yàn)證結(jié)果滿足上述要求，驗(yàn)證結(jié)論合格。

3.3 BGLB培養(yǎng)基驗(yàn)證結(jié)論

標(biāo)準(zhǔn)要求與LST一樣，驗(yàn)證結(jié)論為合格。

3.4 分析討論

培養(yǎng)基驗(yàn)證過程中，也會(huì)出現(xiàn)不滿足實(shí)驗(yàn)要求的情況，應(yīng)該從以下幾個(gè)方面考慮：①試驗(yàn)菌種，試驗(yàn)菌種是否是目標(biāo)菌，這一點(diǎn)涉及菌種的驗(yàn)收是否合格，此外還要考慮菌種是否具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)力，最好是新鮮活化的。②操作規(guī)范，因?yàn)樯婕?種菌株，在生物安全柜中同時(shí)操作極易造成交叉污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度的影響極大，建議在不同的生物安全柜中操作，條件不允許的情況下可以分批次進(jìn)行菌懸液的制備。③培養(yǎng)基自身的質(zhì)量問題。對(duì)微生物檢驗(yàn)來說，主要采用商品化脫水合成培養(yǎng)基。因此在采購商品化脫水合成培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)仔細(xì)檢查外觀產(chǎn)品批號(hào)、有效期、培養(yǎng)基的pH值、包裝完整性等等，做好接收記錄。對(duì)于新開封的培養(yǎng)基，應(yīng)記錄首次開封日，并在開封后6個(gè)月內(nèi)用完。

4 結(jié)論

微生物種類很多且較復(fù)雜，檢驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性與準(zhǔn)確度會(huì)受到培養(yǎng)基質(zhì)量的直接影響，培養(yǎng)基的驗(yàn)證是內(nèi)部質(zhì)量控制的重要一環(huán)，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)GB 4789.28-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》中闡述的方法進(jìn)行了細(xì)化，對(duì)實(shí)驗(yàn)的可操作性進(jìn)行了全面而具體的分析，盡管本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是滿意的，但實(shí)驗(yàn)中還是存在各種風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)和可能存在的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了總結(jié)與分析，為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制提供了良好的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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