氧化苦參堿對哮喘小鼠肺組織MUC5AC表達的影響

蘭露莎 趙兵兵 陳強 楊紅宇

摘要：目的：探討氧化苦參堿對哮喘小鼠肺組織的MUC5AC和TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13因子表達的影響。方法：用Al（OH）3和卵清白蛋白誘發(fā)BALB/c小鼠過敏性哮喘，哮喘模型建立后，予氧化苦參堿或地塞米松進行治療，分別在治療后第5、15天處死部分小鼠，留存血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織進行檢測。采用ELISA法檢測血清和支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13因子的含量，qRT-PCR、免疫組化法、免疫印跡法檢測肺組織MUC5AC的mRNA和蛋白質(zhì)表達情況。結(jié)果：在治療后第5天和第15天時，氧化苦參堿治療組或氧化苦參堿和地塞米松聯(lián)合治療組血清或支氣管肺泡灌洗液的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13含量均較哮喘組降低（P<0.01或P<0.05）;哮喘組肺組織TLR4的mRNA和蛋白表達與正常組無差異，MUC5AC的mRNA和蛋白表達較正常組顯著增高，氧化苦參堿治療組或氧化苦參堿和地塞米松聯(lián)合治療組可上調(diào)TLR4的mRNA和蛋白表達，下調(diào)MUC5AC的mRNA和蛋白表達，以氧化苦參堿和地塞米松聯(lián)合治療組顯著（P<0.01）。結(jié)論?氧化苦參堿可通過上調(diào)TLR4的表達調(diào)節(jié)小鼠的免疫應(yīng)答，下調(diào)TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13因子的表達或含量減輕哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)，通過下調(diào)MUC5AC的表達控制哮喘小鼠氣道粘液過度分泌，且與地塞米松聯(lián)合使用該作用更顯著。

關(guān)鍵詞：氧化苦參堿;哮喘;MUC5AC;TLR4;小鼠

前言

氧化苦參堿（Oxymatrine， OMT）是從豆科屬植物苦參或平科植物廣豆根中分離出來的生物堿， 又名苦參素。它的化學(xué)分子式為C15H24N2O2，具有四環(huán)的喹嗪啶類結(jié)構(gòu)， ， ，易溶于水，分子量為264，無色結(jié)晶。由于氧化苦參堿的廣泛臨床應(yīng)用，對其藥理作用及作用機制的研究也越來越引起相關(guān)醫(yī)藥學(xué)者的極大興趣。近年來，大量研究表明氧化苦參堿具有利尿、抗病原體、免疫作用等廣泛的藥理作用[1， 2，]，顯現(xiàn)出具有新用途開發(fā)的意義。近年研究顯示，氧化苦參堿在哮喘的治療上有顯著療效，能抑制氣道炎癥及抗氣道高反應(yīng)性等作用，但機制不詳。

本研究通過建立過敏性哮喘小鼠模型，小鼠氣道粘蛋白MUC5AC基因和蛋白表達情況的觀察，深入探討OMT對哮喘模型小鼠哮喘的干預(yù)機制，為民族藥開拓新的藥理作用。

1 材料

1.1 BALB/c小鼠，雌性，4-6周齡，SPF級（合格證號SYXK（黔）2012-001），購自貴州省實驗動物工程中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（黔）2012-001。

1.2 試劑和試劑盒：2% Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant，購自InvivoGen公司（Lot #5113）， 卵清白蛋白（Albumin from chicken egg white， OVA），購自sigma公司（批號1001988500），注射用地塞米松磷酸鈉，購自馬鞍山豐原制藥有限公司（批號150512-1）。氧化苦參堿（純度99.0%），購自中國藥品生物檢定所，為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，批號110780-201007。小鼠TNF-α（JEM-12）、IL-4（JEM-04）和 IL-5（JEM-03）定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，購自安徽巧伊生物科技有限公司小鼠IL-13定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，購自聯(lián)科生物科技有限公司（221341235）。動物組織總RNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司（#03901），Prime ScriptTM RT reagent Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，購自TAKARA BIO INC.。BCA 蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物有限公司。兔抗MUC5AC多克隆抗體、兔抗GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 IgG 抗體購自博士德生物工程有限公司。GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒，基因科技（上海）有限公司。PVDF購自美國Millipore公司，PAGE電泳試劑、ECL 發(fā)光液購自美國BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 哮喘小鼠模型的建立及實驗分組?根據(jù)文獻的方法并予以改進建立哮喘模型：第1、8、15天腹腔注射OVA及氫氧化鋁凝膠混合液0.2ml（內(nèi)含OVA60?g及2.25mg氫氧化鋁凝膠）致敏;第21天開始用5%OVA溶液8ml行超聲霧化，每次30min，連續(xù)霧化5天進行激發(fā)。正常對照組用生理鹽水代替OVA進行致敏和霧化。54只SPF級BALB/c小鼠，雌性，4-6周齡，隨機分為6組，每組9只：①CON組，用生理鹽水代替OVA進行致敏和霧化，不給藥;②AST組，按上述方法進行致敏和激發(fā)，不給藥;③TRE組，按上述方法進行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min腹腔注射地塞米松（0.5mg/kg）;④OMT-H組，按上述方法進行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min腹腔注射OMT（25mg/kg/D）;⑤OMT-M組，按上述方法進行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min腹腔注射OMT（12.5mg/kg/D）;⑥OMT-L組，按上述方法進行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min腹腔注射OMT（6.25mg/kg/D）。于治療后第5天處死小鼠3只/組，同時①摘眼球取血并制備血清凍存于-20℃;②從氣管注射無菌NS 0.5ml入肺，抽吸3次后將抽出液體即支氣管肺泡灌洗液（BALF）凍存于-20℃;③分別稱小鼠體重和肺組織重量并記錄;④取右下肺葉置于4%多聚甲醛中固定;⑤余下肺組織凍存于-80℃。各組小鼠不再激發(fā)，隔天給予相應(yīng)藥物1次，持續(xù)5次后，處死小鼠，留存標(biāo)本及相應(yīng)檢查同前。

2.2血清及BALF中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量檢測?根據(jù)試劑盒說明書方法進行，根據(jù)檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣品中指標(biāo)因子的含量，制作柱形圖。

2.3肺組織MUC5AC mRNA表達情況的檢測?采用real time PCR法， MUC5AC上游引物5- ACACCGCTCTGATGTTCCTCACC-3，下游引物5- ATGTCCTGGGTTGAAGGCTCGT-3;GAPDH上游引物5- CATGGCCTTCCGTGTTCCTA -3，下游引物5- GCGGCACGTCAGATCCA -3。每個樣品各取約20mg肺組織，參照說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以2μL cDNA為模板行real time PCR檢測。反應(yīng)條件：預(yù)變性（95℃，30 s），PCR反應(yīng)（Repeat 40，95℃，5 s;52℃，30s）。確定Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，記錄各組的Ct值。分別以GDPDH為內(nèi)參，計算各組樣本中MUC5AC基因的表達量，并對表達量的比值（2-△△Ct）進行分析。

2.4免疫組織化學(xué)法檢測肺組織MUC5AC蛋白的表達?常規(guī)方法制備肺組織石蠟切片，采用免疫組化SP法進行操作。陽性部位成棕褐色。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件進行圖像分析，取平均積分光密度值表示目的蛋白的表達水平。

2.5免疫印跡法檢測肺組織MUC5AC蛋白的表達?試劑盒方法提取小鼠肺組織的總蛋白質(zhì)和細胞核蛋白質(zhì)，BCA法定量蛋白質(zhì)，常規(guī)方法行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、顯影，用QuantityOne軟件分析曝光條帶，各蛋白條帶的灰度值與相應(yīng)的GAPDH條帶灰度值的比值進行半定量分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法?各組所得計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用SPSS19.0軟件處理數(shù)據(jù)，兩組間均數(shù)比較用獨立樣本t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量?在治療后第5天和第15天時，AST組血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量均顯著高于正常組，TRE組和OMT-H組的血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量顯著下調(diào)（見圖1，P<0.05）。

3.2 小鼠BALF中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量?在治療后第5天和第15天時，MOD組BALF中的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量均較正常組明顯增高，TRE組和OMT-H和M組的血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量下調(diào)（P<0.05）（見圖2）。

3.3 小鼠肺組織MUC5AC mRNA的表達?qRT-PCR的結(jié)果顯示，哮喘小鼠肺組織MUC5AC基因在治療第5天或15天時較正常組均明顯增高，而治療TRE組和OMT各組可下調(diào)MUC5AC基因的表達（見圖3）。

3.4 小鼠肺組織MUC5AC蛋白的表達?免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，MUC5AC蛋白主要表達在支氣管上皮細胞，存在于胞漿內(nèi)，陽性染色表現(xiàn)為棕褐色顆粒。治療5天或15天后，哮喘小鼠肺組織MUC5AC 蛋白表達明顯高于正常組，而TRE組和OMT各組肺組織MUC5AC蛋白的表達較AST組減少（見圖4A）。免疫印跡結(jié)果顯示，哮喘小鼠肺組織MUC5AC 蛋白表達明顯高于正常組，而TRE組和OMT各組肺組織MUC5AC蛋白的表達下調(diào)（P<0.05）（見圖4B）。

4討論

苦參當(dāng)中含有大量的生物堿，其中含量最高的是苦參堿和氧化苦參堿。國內(nèi)外大量的研究表明，苦參堿類化合物有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗病毒、免疫抑制、保肝利膽、抗寄生蟲等多方面的藥理作用[1，2]。氧化苦參堿因其具有特殊的氧結(jié)構(gòu)，從而改變了藥物分子的極性，也因此具有了比苦參堿更獨特的作用機理和療效[22]。氧化苦參堿的抗炎作用是其治療哮喘的重要藥理機制，它能起到抗炎、平喘的作用[3]。

近年來，隨著對OMT研究的不斷深入，其在呼吸系統(tǒng)方面作用也逐漸被人們重視[21]。支氣管哮喘（簡稱哮喘）是全球范圍內(nèi)威脅公眾健康的常見的慢性呼吸道炎癥性疾病，全世界約有3億人患哮喘[4，5]。炎癥、重塑及粘液高分泌是支氣管哮喘的重要病理表現(xiàn)[23]。Toll樣受體（Toll-like receptor， TLR）自1997年發(fā)現(xiàn)至今，已發(fā)現(xiàn)十余種，其中TLR4在哮喘氣道慢性炎癥的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用，參與了哮喘炎癥與氣道重塑的病理過程和免疫應(yīng)答[3]。TLR4通過跨膜結(jié)構(gòu)將病原相關(guān)分子刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞內(nèi)，產(chǎn)生復(fù)雜的級聯(lián)信號反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細胞因子合成與釋放，介導(dǎo)腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素（IL）等炎性介質(zhì)基因的表達，引起相應(yīng)炎性介質(zhì)的合成和釋放[6，7]。氣道粘液是一種具有粘附性和彈性的粘性膠，其中主要發(fā)揮功能的是粘蛋白（mucin，MUC），由氣道杯狀細胞分泌產(chǎn)生的粘蛋白MUC5AC表達和分泌增多被認(rèn)為是氣道粘液高分泌的分子學(xué)基礎(chǔ)，反映了氣道粘液分泌的情況[8，9，10]。

氧化苦參堿的藥理作用廣泛，初步顯現(xiàn)出多種有新藥開發(fā)意義的藥理作用，但系統(tǒng)研究不夠，在此方面的產(chǎn)品報道也較少，大多停留在研究階段，希望能加強氧化苦參堿在醫(yī)療應(yīng)用方面的產(chǎn)品研制和開發(fā)[11，12]。同時以氧化苦參堿的經(jīng)典論述為指導(dǎo)，結(jié)合現(xiàn)代的研究方法，組織生命科學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)等多學(xué)科協(xié)作，展開有效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用特點、作用機理等的綜合研究，并將動物實驗與臨床實驗相結(jié)合，動物實驗?zāi)荜U明藥物的作用機制，同時也是進行臨床實驗的基礎(chǔ)[13，14，17]。臨床實驗排除了安慰劑效應(yīng)、疾病自限、向均數(shù)回歸等現(xiàn)象的干擾，是檢驗氧化苦參堿臨床療效的最終手段[16，19]。若療效可靠，則臨床使用量迅速增長，故進一步加強對氧化苦參堿的研究具有重要的社會意義和巨大的經(jīng)濟效益[15，18，20]。

課題組前期的研究證實氧化苦參堿具有治療哮喘的作用，但具體機制不清。因此本文通過對實驗小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中多種炎性介質(zhì)的檢測、肺組織中TLR4基因和蛋白表達情況的觀察，以及粘蛋白MUC5AC基因和蛋白表達情況的觀察，探討氧化苦參堿對哮喘模型小鼠哮喘的干預(yù)機制，為民族藥開拓新的藥理作用。

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基金項目：貴州省科技廳省科技合作計劃項目（黔科合LH字[2016]7369）

貴州省國家級、省級創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（DC 201710660036）

作者簡介：蘭露莎（1984-），女，碩士研究生，實驗師，貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心.

通訊作者：楊紅宇（1970-），男，高級實驗師.