龍頭魚ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

褚夢(mèng)潔 王錚 林彥均 朱蘭倩 胡靜雯

摘 要：以Tris平衡酚-氯仿法提取的龍頭魚基因組DNA為ISSR-PCR擴(kuò)增模板，采用單因素試驗(yàn)法，對(duì)影響PCR擴(kuò)增體系的dNTPs、模板DNA、引物濃度和Taq DNA聚合酶4種試劑的用量作為獨(dú)立因素進(jìn)行優(yōu)化，創(chuàng)建了最適合龍頭魚的ISSR-PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明：20μL的PCR反應(yīng)液的組分和用量為含Mg2+的10×PCR Buffer 2.0μL，dNTPs2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，引物1.0μL，DNA模板1.4μL，雙蒸水12.9μL時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為龍頭魚后續(xù)開展ISSR遺傳多樣性分析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：龍頭魚;ISSR-PCR;反應(yīng)條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S917 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

龍頭魚（Harpadon nehereus Hamilton，1822）俗稱狗母魚、九肚魚、蝦潺、豆腐魚、鼻涕魚等，為燈籠魚目（Myctophiformes），龍頭魚科（Harpadontidae），龍頭魚屬（Harpadon）的底層中小型經(jīng)濟(jì)魚類，在我國(guó)黃海南部、東海和南海均廣泛分布，也是定制網(wǎng)和底拖網(wǎng)的重要漁獲對(duì)象[1，2]。龍頭魚營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)細(xì)嫩，是受到消費(fèi)者廣為喜愛的海產(chǎn)品之一。20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著近岸漁業(yè)資源開發(fā)力度的加大和水域環(huán)境的污染，龍頭魚種群結(jié)構(gòu)及數(shù)量分布遭到了一定程度的破壞，加之龍頭魚本身存在較嚴(yán)重的同類自殘現(xiàn)象，導(dǎo)致近年來(lái)部分海區(qū)龍頭魚群體出現(xiàn)低齡化和小型化問題[3]，而研究龍頭魚種群遺傳多樣性使得我們能夠發(fā)現(xiàn)龍頭魚群體中能夠適應(yīng)環(huán)境變化的個(gè)體，為保護(hù)龍頭魚群體因?yàn)樽詺垎栴}而出現(xiàn)的低齡化和小型化問題提供解決可能性。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，也是物種適應(yīng)進(jìn)化的基礎(chǔ)，遺傳變異越豐富，物種應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)。較高水平的進(jìn)化潛力也將有助于減緩因不適應(yīng)進(jìn)化所導(dǎo)致的物種滅絕過(guò)程，從而維持整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的多樣性[4-5]。遺傳多樣性的檢測(cè)手段從不同角度和層次來(lái)看，主要包括形態(tài)標(biāo)記（Morphological markers）、細(xì)胞標(biāo)記（Cytological markers）、生化標(biāo)記（Biochemical markers）和分子標(biāo)記（Molecular markers）4大類，其中分子標(biāo)記能夠從DNA水平揭示物種的變異程度，具有數(shù)量大、多態(tài)性高，操作簡(jiǎn)便迅速且受組織、發(fā)育階段、季節(jié)和環(huán)境等因素的限制小等優(yōu)勢(shì)，成為了遺傳多樣性評(píng)估、品種改良與選育等領(lǐng)域的主要技術(shù)手段[6-7]。目前，國(guó)內(nèi)外圍繞龍頭魚遺傳多樣性開展的研究工作主要集中在線粒體DNA序列分析和核基因SSR、SRAP分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域[8-12]。

簡(jiǎn)單重復(fù)間序列（Inter simple sequence repeat，ISSR）是在簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSR）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，能夠?qū)φ麄€(gè)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，變異豐富且多態(tài)性高，相較于SSR、RAPD等分子標(biāo)記具有更好的穩(wěn)定性，可以檢測(cè)到更多的遺傳變異[13-14]。由于ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果受到Taq DNA聚合酶、引物、模板、dNTPs等多種因素的影響[15]，因此，在利用該技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性研究時(shí)，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。本研究以傳統(tǒng)Tris平衡酚-氯仿法提取的龍頭魚基因組DNA為模板，比較分析了ISSR反應(yīng)體系中dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板濃度對(duì)PCR結(jié)果的影響，建立了適用于龍頭魚的ISSR最佳反應(yīng)體系，為進(jìn)一步開展龍頭魚分子標(biāo)記研究以及其遺傳多樣性評(píng)價(jià)和親緣關(guān)系分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以2019年10月采集自浙江省舟山沿海的龍頭魚為材料，剪取背部肌肉組織，采用傳統(tǒng)的Tris平衡酚-氯仿法提取龍頭魚DNA[16]，使用英國(guó)柏點(diǎn)（BioDrop DUO）多功能超微量分光光度計(jì)測(cè)定A260nm/A280nm值并計(jì)算DNA濃度。PCR擴(kuò)增反應(yīng)所用的Taq酶、引物、10×Buffer、dNTPs等試劑均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。

1.2 引物篩選和退火溫度確定

根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia，簡(jiǎn)稱UBC）公布的100余條ISSR引物，參考在魚類中具有較好擴(kuò)增多態(tài)性的引物，設(shè)置退火溫度范圍在47～62℃之間的8個(gè)溫度（47.0℃、48.0℃、49.8℃、52.7℃、56.2℃、58.9℃、608℃、62.0℃），梯度PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出具有較高分辨率和特異性的12條ISSR引物（表1），從中再進(jìn)行3～4次復(fù)篩，最終確定引物881為本實(shí)驗(yàn)最適引物。

1.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系與梯度設(shè)計(jì)

PCR反應(yīng)體系為20μL，包括含Mg2+的10×PCR Buffer 2μL、dNTPs 1.6μL、引物 1.6μL、Taq聚合酶0.2μL、DNA模板8μL，并用雙蒸水（13.8μL）補(bǔ)至終體積為20μL。在此基礎(chǔ)上，對(duì)PCR擴(kuò)增中4個(gè)參數(shù)進(jìn)行體積梯度設(shè)置（表2）。參考胡鳳榮等[17]和曹冬梅等[18]的研究，將PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性4min;94℃變性40s，56.2℃退火45s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物4℃保存。每個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，直至篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性和重復(fù)性好的各因素最優(yōu)組合。擴(kuò)增結(jié)束后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并在上海天能（Tanon 2500）全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析儀上拍照觀察。

2 結(jié)果分析

2.1 DNA模板濃度對(duì)ISSR-PCR的影響

DNA模板含量是制約擴(kuò)增產(chǎn)物效率及特異性的一個(gè)重要因子。模板含量過(guò)低，會(huì)使分子碰撞的幾率降低，沒有擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增不穩(wěn)定;模板含量過(guò)高，又會(huì)增加非特異性產(chǎn)物的數(shù)量[18]。圖1可以看出，本研究中DNA模板濃度變化對(duì)ISSR-PCR并未產(chǎn)生顯著的影響。當(dāng)模板體積在0.8-1.8μL范圍內(nèi)時(shí)，擴(kuò)增條帶較為清晰，當(dāng)體積為1.4μL和1.6μL時(shí)擴(kuò)增條帶最為清晰明亮，從節(jié)約實(shí)驗(yàn)材料考慮，故選擇模板體積為1.4μL。

2.2 dNTPs濃度對(duì)ISSR-PCR的影響

dNTPs是進(jìn)行PCR反應(yīng)的重要原材料之一，dNTPs的濃度變化對(duì)PCR的擴(kuò)增有著密不可分的關(guān)系。dNTPs濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致聚合酶錯(cuò)誤摻入，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，過(guò)低則會(huì)造成擴(kuò)增產(chǎn)物量少[19]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的8個(gè)dNTPs濃度均能擴(kuò)增出條帶（圖2），條帶的清晰程度肉眼難以區(qū)別。在降低經(jīng)濟(jì)成本與保證清晰度的前提下，建議將dNTPs濃度調(diào)整為2.5μL，此時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰且拖帶較少。

2.3 Taq聚合酶濃度對(duì)ISSR-PCR的影響

Taq聚合酶濃度過(guò)高會(huì)引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則PCR產(chǎn)物量減少[20]。本實(shí)驗(yàn)比較了0.5μL、0.4μL、0.3μL、0.2μL、0.1μL五個(gè)梯度的Taq DNA聚合酶濃度對(duì)ISSR-PCR效率的影響，結(jié)果表明五種濃度Taq DNA聚合酶均可擴(kuò)增出條帶，相較而言0.2μL和0.4μL時(shí)擴(kuò)增條帶更清晰（圖3），從經(jīng)濟(jì)成本角度選擇0.2μL Taq DNA聚合酶作為龍頭魚ISSR-PCR實(shí)驗(yàn)最優(yōu)選擇。

2.4 引物濃度對(duì)ISSR-PCR的影響

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，濃度太低會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)量少，濃度過(guò)高又會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，增加引物間形成二聚體的幾率[21]。本研究中當(dāng)引物體積為1.0μL時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰，當(dāng)體積為0.8μL時(shí)部分條帶缺失且較模糊（圖4）。

3 討論

ISSP-PCR擴(kuò)增受Mg2+、dNTPs、引物和DNA聚合酶等因素的影響，且各因素之間存在著相互作用。本實(shí)驗(yàn)中基因組DNA經(jīng)電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量較好，在總體積20μL的反應(yīng)體系中，模板DNA的濃度變化并未明顯地影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明ISSR-PCR反應(yīng)對(duì)DNA模板的用量沒有嚴(yán)格限定。相反的，Taq聚合酶是保證實(shí)驗(yàn)成功的先決條件，Taq聚合酶濃度會(huì)極大地影響反應(yīng)結(jié)果，濃度過(guò)高不僅不會(huì)提高擴(kuò)增效率，反而容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，使條帶變得模糊不清。其次，過(guò)量使用Taq聚合酶也增加了經(jīng)濟(jì)成本，降低了實(shí)驗(yàn)效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，dNTPs濃度與引物濃度越高，擴(kuò)增條帶越清晰度也越高，但由于最高濃度的擴(kuò)增條帶與其相鄰條帶間清晰度差異較小，肉眼難以區(qū)分二者差別，為節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，故選擇第二高的條帶。

綜上所述，根據(jù)設(shè)計(jì)的變量進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，本研究最終確定了龍頭魚ISSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)條件和體系，即95℃預(yù)變性4min;94℃變性40s，58.9℃退火45s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min，反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。PCR擴(kuò)增體系采用20μL的總反應(yīng)液，包含10×PCR Buffer（含Mg2+）20μL，dNTPs 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，引物1.0μL，DNA模板1.4μL，雙蒸水12.9μL。采用本研究所確定的ISSR標(biāo)記的PCR體系對(duì)龍頭魚基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了清晰度高、重復(fù)性好的DNA譜帶，為使用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)龍頭魚進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析奠定了基礎(chǔ)，也為其后續(xù)遺傳學(xué)研究提供了參考資料。

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基金項(xiàng)目：浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目（2019R411013）;浙江海洋大學(xué)本科生發(fā)展性資助項(xiàng)目;浙江海洋大學(xué)“水產(chǎn)”省一流學(xué)科大學(xué)生創(chuàng)新性科研項(xiàng)目（11034060216）

作者簡(jiǎn)介：褚夢(mèng)潔（1999—），女，漢族，浙江蕭山人，本科，研究方向：海洋資源與環(huán)境。